Pesticidi igrajo ključno vlogo pri reševanju globalnega pomanjkanja hrane in boju proti vektorskim boleznim pri ljudeh. Vendar pa naraščajoči problem odpornosti na pesticide nujno zahteva odkritje novih spojin, ki ciljajo na premalo izkoriščene tarče. Kanali prehodnega receptorskega potenciala žuželk (TRPV) – Nanzhong (Nan) in neaktivni (Iav) – lahko tvorijo heterologne kanale (Nan-Iav) in se lokalizirajo v mehanosenzoričnih organih, ki posredujejo geotropizem, sluh in propriocepcijo pri žuželkah. Nekateri pesticidi, kot je afidopirolidon (AP), ciljajo na Nan-Iav prek neznanih mehanizmov. AP je učinkovit proti žuželkam, ki sesajo in prebadajo (hemiptera), saj preprečuje hranjenje z motenjem delovanja filamentov. AP se lahko veže samo na Nan, vendar lahko samo Nan-Iav interagira z agonisti, vključno z endogenim nikotinamidom (NAM), s čimer kaže aktivnost kanalov. Kljub potencialu Nan-Iav kot tarče insekticidov je malo znanega o njegovi sestavi kanalov, regulatornih vezavnih mestih in regulaciji, odvisni od Ca2+, kar ovira nadaljnji razvoj insekticidov. V tej študiji smo s krioelektronsko mikroskopijo določili strukturo Nan-Iav pri žuželkah Hemiptera v stanju brez kalmodulinskega liganda, kot tudi z AP in NAM na meji citoplazemske domene ankirinskih ponovitev (ARD). Presenetljivo smo ugotovili, da lahko protein Nan sam tvori pentamer, ki ga stabilizirajo interakcije ARD, ki jih posreduje AP. Ta študija razkriva molekularne interakcije med insekticidi in agonisti ter Nan-Iav, poudarja pomen ARD pri delovanju in sestavljanju kanalov ter raziskuje mehanizem regulacije Ca2+.
Glede na vse hujše globalne podnebne spremembe je slabšanje svetovne prehranske varnosti eden glavnih izzivov 21. stoletja, ki ima kaskadne posledice za družbo.1,2Poročilo Svetovne zdravstvene organizacije o stanju prehranske varnosti in prehrane v svetu za leto 2023 (SOFI) ocenjuje, da približno 2,33 milijarde ljudi po vsem svetu trpi zaradi zmerne do hude prehranske negotovosti, kar je dolgoletni problem.3,4Žal se zaradi škodljivcev in patogenov vsako leto izgubi od 20 % do 30 % ali več pridelka, globalno segrevanje pa naj bi poslabšalo odpornost škodljivcev in ranljivost pridelkov.4, 5, 6, 7, 8Razvoj pesticidov je ključnega pomena ne le za zaščito pridelkov pred škodljivci in zmanjšanje širjenja patogenov, ki jih prenašajo vektorji, temveč tudi za boj proti vektorskim človeškim boleznim, kot so denga, malarija in Chagasova bolezen, ki so vse bolj odporne na pesticide.5, 9, 10, 11
Med glavnimi tarčami nevrotoksičnih insekticidov heterotetramerni TRPV kanal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) predstavlja razred insekticidov, odkritih šele v zadnjem desetletju, vključno s komercialno dostopnimi insekticidi, kot sta imidakloprid in piraklostrobin.12, 13, 14Polsintetični insekticid afidopirolifen (AP) je nedavno razvit in komercializiran izdelek, katerega glavna sestavina je aktivni insekticid Inscalis®, ki veže AP s subnanomolarno aktivnostjo.15AP kaže nizko akutno toksičnost za opraševalce, koristne žuželke in druge neciljne organizme, in če se uporablja v skladu z navodili na etiketi, lahko zmanjša odpornost na druge insekticide.16, 17, 18Nan in Iav sta široko razširjena med vrstami žuželk, sočasno se izražata le v nevronih receptorjev za raztezanje akordov anten in okončin ter sta ključnega pomena za sluh, zaznavanje gravitacije in propriocepcijo.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprid in piraklostrobin stimulirajo kompleks Nan-Iav z edinstvenim mehanizmom, kar na koncu zavira proprioceptivno signalno transdukcijo.13, 16, 23Pri žuželkah, ki sesajo in prebadajo (hemiptera), kot so listne uši in beli muhi, izguba propriocepcije poslabša njihovo sposobnost hranjenja, kar na koncu vodi v smrt.13,24Zanimivo je, da AP kaže visoko afiniteto za kompleks Nan-Iav in nizko afiniteto za sam Nan. Vezava AP na Nan-Iav inducira električni tok, vendar vezava na Nan sam ne spodbuja aktivnosti kanalov. Iav sam se sploh ne veže na AP.16To kaže, da se Nan in Iav lahko vežeta in tvorita različne komplekse kanalov Nan-Iav (npr. z različnimi stehiometričnimi razmerji ali različnimi razporeditvami znotraj istega stehiometričnega razmerja) ali da se AP lahko veže na več mest. Poleg tega se naravni agonist nikotinamid (NAM) veže na Nan-Iav pri drozofili z mikromolarno afiniteto in kaže učinke, podobne ušesom listnih uši (AP) in vitro.16,25in zaviranje razmnoževanja in hranjenja listnih uši, kar na koncu vodi v njihovo smrt25,26Ti podatki sprožajo številna vprašanja. Na primer, ostaja nejasno, kako nastane heterodimer Nan-Iav, katera vezavna mesta se uporabljajo za modulacijo majhnih molekul in kako te majhne molekule uravnavajo delovanje kanalov z zaviranjem propriocepcije. Poleg tega ostajajo nejasni razlogi, zakaj je Nan sam neaktiven in ima nizko afiniteto za AP, medtem ko je heterodimer Nan-Iav aktiven in se veže na AP z večjo afiniteto. Nazadnje je malo znanega o regulaciji delovanja Nan-Iav, odvisni od Ca2+, in o tem, kako je ta integrirana v procese nevronske signalizacije.13,21
V tej študiji smo s kombinacijo krioelektronske mikroskopije, elektrofiziologije in tehnik vezave radioligandov razjasnili sestavljanje Nan-Iav in mehanizem njegove vezave na regulatorje majhnih molekul. Poleg tega smo zaznali konstitutivno vezan kalmodulin (CaM) na Iav in AP-stabilizirane Nan pentamere. Ti rezultati ponujajo pomemben vpogled v regulacijo kalcijevih ionov v kanalih, sestavljanje kanalov in dejavnike, ki določajo afiniteto vezave liganda. Še pomembneje pa je, da smo potrdili, da ima ARD osrednjo vlogo v teh procesih. Naša študija celotnih kanalov žuželk, vezanih na ustrezne kmetijske pesticide.27, 28, 29odpira možnosti za razvoj industrije pesticidov, izboljšuje učinkovitost in specifičnost pesticidov ter omogoča uporabo spojin, usmerjenih v TRPV, na drugih vrstah za reševanje globalne prehranske varnosti in širjenja bolezni, ki jih prenašajo vektorji.
Ugotovili smo tudi, da Nan-Iav regulira Ca2+, mehanizem regulacije pa posreduje konstitutivno vezan CaM. Pomembno je, da se ta od Ca2+ odvisna regulacija Nav s strani CaM bistveno razlikuje od mehanizmov regulacije drugih ionskih kanalov (npr. napetostno odvisnih Na+ kanalov in TRPV5/6 kanalov).52, 53, 54, 55, 56, 57V kanalu Nav1.2 se C-terminalna domena CaM vijačno povezuje s C-terminalno domeno (CTD), Ca2+ pa inducira vezavo svoje N-terminalne domene na distalni del CTD.56V kanalu TRPV5/6 se C-terminalna domena CaM veže na CTH, Ca2+ pa povzroči podaljšanje svoje N-terminalne domene navzgor v pore, s čimer blokira prepustnost kationov.53,54Predlagamo model za funkcijo Nan-Iav-CaM, ki jo regulira Ca2+ (slika 4h). V tem modelu se N-terminalna domena CaM konstitutivno veže na C-terminalno domeno (CTH) Iav. V stanju mirovanja (nizka koncentracija [Ca2+]) C-terminalna domena CaM interagira z Nan, stabilizira konformacijo ARD in s tem spodbuja odpiranje kanalov. Vezava agonista/insekticida na kanal povzroči odpiranje por, kar vodi do dotoka Ca2+. Ca2+ se nato veže na CaM, kar povzroči disociacijo C-terminalne domene od ARD Nan. Ker blokiranje vezave CaM v bistvu odpravi zaviralni učinek Ca2+, ta disociacija modulira mobilnost ARD, kar povzroči inhibicijo ali desenzibilizacijo, odvisno od Ca2+. Hitro okrevanje tokov kanalov po eluciji kalcijevih ionov (slika 4g) kaže, da ta mehanizem omogoča hitre odzive na nevronske signale, ki jih posreduje Ca2+. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da ima C-terminalna regija proteina Iav, ki je še vedno slabo razumljena, tudi druge vloge pri ciljanju kanalov in regulaciji toka.21
Končno, naša študija predstavlja visokoločljivostno strukturo kompleksa TRP kanalov insekticida in insekticida, ki je kmetijskega pomena – odkritje, ki nam je bilo prej neznano. Opredelili smo strukturo in funkcijo žuželčinega kanala v človeških celicah (HEK293S GnTi–) in ne v celicah žuželk. Glede na naraščajočo odpornost na insekticide in nenehni pritisk na prehransko varnost in patogene naše delo zagotavlja pomembne informacije, ki bodo olajšale razvoj novih insekticidov v korist zdravja ljudi in globalne prehranske varnosti. Študije so pokazale, da so insekticidi, kot je AP, učinkoviti proti nekaterim škodljivcem, če se uporabljajo v skladu z navodili na etiketi, in imajo nizko akutno toksičnost za koristne opraševalce, kar dokazuje njihovo okoljsko varnost.13,16Poleg tega je testiranje nekaterih derivatov AP na komarjih pokazalo, da sčasoma izgubijo sposobnost letenja. Razumevanje, kako se te modulacijske spojine vežejo na Nan-Iav, bo olajšalo modifikacijo obstoječih spojin ali razvoj novih spojin za učinkovitejše innatančenzatiranje škodljivcev. Naša študija dokazuje, da je vmesnik Nan-Iav ARD ključnega pomena ne le za uravnavanje aktivnosti endogenih spojin, pesticidov in Ca2+-CaM, temveč tudi za sestavljanje kanalov. Predlagamo, da bi lahko prekinitev sestavljanja heterodimerov z majhnimi molekulami predstavljala edinstven in obetaven pristop k razvoju zaviralcev ionskih kanalov.
Izmed osmih ortolognih genov so bili izbrani geni polne dolžine rjavega hrošča (Halyomorpha halys) Nanchung in Inactive, ki kažejo odlično stabilnost v detergentih. Sintetizirani geni so bili kodonsko optimizirani za izražanje pri ljudeh in klonirani v vektor pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) z uporabo restrikcijskih mest XhoI in EcoRI. To je zagotovilo, da so bili kloni v okviru z oznakami C-terminal GFP-FLAG-10xHis in mCherry-FLAG-10xHis, ki jih cepi proteaza HRC-3C (PPX), kar omogoča neodvisno...izrazZa kloniranje Nanchunga in Inactivea v vektor pBacMam so bili uporabljeni naslednji primerji:
Mikroskopske slike posameznih delcev so bile pridobljene na transmisijskem elektronskem mikroskopu Titan Krios G2 (FEI), opremljenem s kamero K3 in energijskim filtrom Gatan BioQuantum. Mikroskop je deloval pri 300 keV, z energijsko nastavitvijo 20 eV, velikostjo vzorčnega slikovnega piksla 1,08 Å/piksel (nominalna povečava 81.000x) in gradientom defokusiranja od -0,8 do -2,2 μm. Video snemanje je bilo izvedeno s hitrostjo 40 sličic na sekundo z mikroskopom Latitude S (Gatan) z nominalno hitrostjo doze 25 e–px−1 s−1, časom osvetlitve 2,4 s in skupnim odmerkom približno 60 e–Å−2.
Korekcija gibanja, ki ga povzroči žarek, in uteževanje odmerka sta bila izvedena na filmu z uporabo MotionCor2 v programu RELION 4.061. Ocena parametra funkcije prenosa kontrasta (CTF) je bila izvedena v programu cryoSPARC z metodo ocenjevanja CTF na osnovi patch-a62. Fotomikrografije z ločljivostjo prilagajanja CTF ≥4 Å so bile izključene iz nadaljnje analize. Običajno je bila za izbiro točk v programu cryoSPARC uporabljena podmnožica 500–1000 fotomikrografij, ki ji je po filtriranju sledilo več krogov 2D klasifikacije, da bi dobili jasno referenčno sliko za izbiro delcev na podlagi predloge. Delce so nato ekstrahirali z uporabo 64-pikselnih omejevalnih okvirjev in 4-kratnega združevanja. Izvedenih je bilo več krogov 2D klasifikacije za odstranitev neželenih kategorij delcev. Začetni 3D model je bil rekonstruiran z uporabo ab initio rekonstrukcije in izpopolnjen z neenakomernim izpopolnjevanjem v programu cryoSPARC. 3D klasifikacija je bila izvedena v programu cryoSPARC ali RELION na podlagi heterogenosti ARD. Ni bilo opaziti pomembne heterogenosti membranskih domen. Delce so bili izpopolnjeni z metodama C1 in C2; Delci z višjo ločljivostjo C2 so bili obravnavani kot simetrični glede na C2 in uvoženi v RELION za Bayesovo prečiščevanje. Delci so bili nato preneseni nazaj v cryoSPARC za končno neenakomerno in lokalno prečiščevanje. Končna ločljivost in število delcev sta prikazana v tabeli 1.
Pri obdelavi pentamerjev Nan+AP smo raziskali različne metode za izboljšanje ločljivosti membranskih domen (zlasti območja por), kot sta odštevanje signalov in maskiranje TMD. Vendar so bili ti poskusi neuspešni zaradi potencialno ekstremne neurejenosti v območju por in splošne heterogenosti TMD. Končna ločljivost je bila izračunana z uporabo maske, ki jo je samodejno ustvarila metoda neenakomerne obdelave v cryoSPARC, predvsem usmerjena na območje ARD. S tem smo dosegli bistveno višjo ločljivost kot membranske domene (zlasti območje VSLD).
Začetni de novo modeli apo oblik Nanchungovih in Inactive virusov so bili najprej ustvarjeni z uporabo programa Coot63, modeli Nanovih in Iav virusov pa z uporabo programa AlphaFold264 za identifikacijo območij z nizko stopnjo zanesljivosti. Modeliranje kalmodulina je temeljilo na prilagoditvah togega telesa modelov z vezavo Ca2+ in brez Ca2+ v PDB pristopih 4JPZ56 oziroma 1CFD65. Modeli so bili izpopolnjeni s sferičnim izpopolnjevanjem, da se zagotovi pravilna stereokemija in dobra geometrija. Fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin in fosfatidilserin so bili nato modelirani kot dobro definirane lipidne gostote, ligandi NAM in AP pa so bili postavljeni v ustrezne gostote v tesnih stikih. Datoteke z omejitvami so bile ustvarjene iz niza SMILES izooblik z uporabo programa eLBOW v programu PHENIX66. Nazadnje so bili modeli izpopolnjeni v realnem prostoru v programu PHENIX z uporabo lokalnega iskanja po mreži in globalne minimizacije z omejitvami sekundarne strukture. Za izboljšanje modela in strukturno analizo je bil uporabljen strežnik MolProbity, ilustracije pa so bile izvedene z uporabo PyMOL in UCSF Chimera X. 67,68,69 Analiza odprtine je bila izvedena z uporabo strežnika HOLE,70 preslikava ohranjenosti zaporedja pa z uporabo strežnika Consurf.71
Statistična analiza je bila izvedena z uporabo programov Igor Pro 6.2, Excel Office 365 in GraphPad Prism 7.0. Vsi kvantitativni podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka (SEM). Za primerjavo dveh skupin je bil uporabljen Studentov t-test (dvostranski, neparni). Za primerjavo več skupin je bila uporabljena enosmerna analiza variance (ANOVA), ki ji je sledil Dunnettov post hoc test. *P< 0,05, **P< 0,01 in ***PVrednosti < 0,001 so bile glede na porazdelitev podatkov ocenjene kot statistično pomembne. Vrednosti Kd in Ki ter njihovi asimetrični 95-odstotni intervali zaupanja so bili izračunani z uporabo programa GraphPad Prism 10.
Za več podrobnosti o metodologiji študije si oglejte povzetek poročila o naravoslovnem portfelju, do katerega je povezana povezava v tem članku.
Začetni model je bil zgrajen z uporabo modelov kalmodulina iz podatkovnih baz PDB 4JPZ in 1CFD. Koordinate so bile shranjene v banki podatkov o beljakovinah (PDB) pod pristopnimi številkami 9NVN (Nan-Iav-CaM brez liganda), 9NVO (Nan-Iav-CaM vezan na nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM vezan na nikotinamid in EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM vezan na afenidolpirolin in kalcij), 9NVR (Nan-Iav-CaM vezan na afenidolpirolin in EDTA) in 9NVS (Nan pentamer vezan na afenidolpirolin). Ustrezne slike krioelektronske mikroskopije so shranjene v zbirki podatkov elektronske mikroskopije (EMDB) pod naslednjimi pristopnimi številkami: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM brez liganda), EMD-49845 (kompleks Nan-Iav-CaM z nikotinamidom), EMD-49846 (kompleks Nan-Iav-CaM z nikotinamidom in EDTA), EMD-49847 (kompleks Nan-Iav-CaM z afidopirolinom in kalcijem), EMD-49848 (kompleks Nan-Iav-CaM z afidopirolinom in EDTA) in EMD-49849 (kompleks Nan pentamer z afidopirolinom). V tem članku so predstavljeni surovi podatki za funkcionalno analizo.
Čas objave: 28. januar 2026