Antihelmintično zdravilo N,N-dietil-m-toluamid (DEET) naj bi zaviral AChE (acetilholinesterazo) in imel potencialne kancerogene lastnosti zaradi prekomerne vaskularizacije. V tem članku prikazujemo, da DEET specifično stimulira endotelijske celice, ki spodbujajo angiogenezo, s čimer poveča rast tumorja. DEET aktivira celične procese, ki vodijo do angiogeneze, vključno s proliferacijo, migracijo in adhezijo. To je povezano s povečano produkcijo NO in izražanjem VEGF v endotelijskih celicah. Utišanje M3 ali uporaba farmakoloških zaviralcev M3 je odpravila vse te učinke, kar kaže na to, da je angiogeneza, ki jo povzroča DEET, občutljiva na M3. Poskusi, ki vključujejo kalcijevo signalizacijo v endotelijskih in HEK celicah, ki prekomerno izražajo receptorje M3, ter študije vezave in priklopa kažejo, da DEET deluje kot alosterični modulator receptorjev M3. Poleg tega DEET zavira AChE, s čimer poveča biološko uporabnost acetilholina in njegovo vezavo na receptorje M3 ter okrepi proangiogene učinke z alosterično regulacijo.
Primarne EC so bile izolirane iz aorte švicarskih miši. Metoda ekstrakcije je bila prilagojena po Kobayashijevem protokolu 26. Mišje EC so bile gojene v gojišču EBM-2, dopolnjenem s 5 % toplotno inaktiviranega FBS, do četrte pasaže.
Učinek dveh koncentracij DEET na proliferacijo HUVEC, U87MG ali BF16F10 smo analizirali z uporabo kompleta CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Na kratko, 5.103 celic na vdolbinico smo zasejali v 96-vdolbinsko ploščo, pustili, da se pritrdijo čez noč, nato pa jih 24 ur obdelali z DEET. Po odstranitvi rastnega medija smo v vsako vdolbinico mikroplošče dodali raztopino za vezavo barvila in celice inkubirali pri 37 °C 30 minut. Stopnje fluorescence smo določili z uporabo večmodnega čitalnika mikroplošč Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemčija), opremljenega z vzbujevalnimi filtri 485 nm in emisijskimi filtri 530 nm.
HUVEC smo zasejali v 96-jamične plošče z gostoto 10⁴ celic na vdolbinico. Celice smo 24 ur tretirali z DEET. Viabilnost celic smo ocenili s kolorimetričnim MTT testom (Sigma-Aldrich, M5655). Vrednosti optične gostote smo dobili na večmodnem čitalniku mikroplošč (Mithras LB940) pri valovni dolžini 570 nm.
Učinke DEET so preučevali z uporabo in vitro testov angiogeneze. Zdravljenje z 10-8 M ali 10-5 M DEET je povečalo nastanek dolžine kapilar v HUVEC (slika 1a, b, beli stolpci). V primerjavi s kontrolno skupino je zdravljenje s koncentracijami DEET od 10-14 do 10-5 M pokazalo, da je dolžina kapilar dosegla plato pri 10-8 M DEET (dodatna slika S2). V in vitro proangiogenem učinku HUVEC, zdravljenih z DEET v koncentracijskem območju 10-8 M in 10-5 M, ni bilo ugotovljene pomembne razlike.
Za določitev učinka DEET na neovaskularizacijo smo izvedli in vivo študije neovaskularizacije. Po 14 dneh so miši, ki so jim injicirali endotelijske celice, predhodno gojene z 10-8 M ali 10-5 M DEET, pokazale znatno povečanje vsebnosti hemoglobina (slika 1c, beli stolpci).
Poleg tega so pri miših s ksenograftom U87MG, ki so jim dnevno (ip) injicirali DEET v odmerku, za katerega je znano, da inducira plazemske koncentracije 10-5 M, kar je normalno pri izpostavljenih ljudeh. v 23. Zaznavne tumorje (tj. tumorje > 100 mm3) so opazili 14 dni po injiciranju celic U87MG v miši. 28. dan se je rast tumorjev pri miših, zdravljenih z DEET, v primerjavi s kontrolnimi mišmi znatno povečala (slika 1d, kvadratki). Poleg tega je obarvanje tumorjev s CD31 pokazalo, da je DEET znatno povečal površino kapilar, ne pa tudi gostote mikrožil. (slika 1e–g).
Za določitev vloge muskarinskih receptorjev pri proliferaciji, ki jo povzroča DETA, je bil uporabljen 10⁻⁶ M ali 10⁻⁶ M DETA v prisotnosti pFHHSiD (10⁻⁶ M, selektivni antagonist receptorjev M3). Obdelava HUVEC s pFHHSiD je popolnoma blokirala proliferativne lastnosti DETA pri vseh koncentracijah (tabela 1).
V teh pogojih smo preučili tudi, ali bi DEET povečal dolžino kapilar v celicah HUVEC. Podobno je pFHHSiD znatno preprečil dolžino kapilar, ki jo povzroča DEET (slika 1a, b, sivi stolpci). Poleg tega so bili podobni poskusi izvedeni z M3 siRNA. Čeprav kontrolna siRNA ni bila učinkovita pri spodbujanju nastajanja kapilar, je utišanje muskarinskega receptorja M3 odpravilo sposobnost DEET-a za povečanje dolžine kapilar (slika 1a, b, črni stolpci).
Poleg tega je pFHHSiD popolnoma blokiral tako 10-8 M ali 10-5 M DEET-inducirano vaskularizacijo in vitro kot neovaskularizacijo in vivo (slika 1c, d, krogi). Ti rezultati kažejo, da DEET spodbuja angiogenezo preko poti, občutljive na selektivne antagoniste receptorjev M3 ali M3 siRNA.
AChE je molekularna tarča DEET-a. Zdravila, kot je donepezil, ki delujejo kot zaviralci AChE, lahko in vitro in v mišjih modelih ishemije zadnjih okončin spodbudijo angiogenezo endotelijskih celic14. Preizkusili smo učinek dveh koncentracij DEET-a na aktivnost encima AChE v HUVEC. Nizka (10-8 M) in visoka (10-5 M) koncentracija DEET-a sta zmanjšali aktivnost endotelijske AChE v primerjavi s kontrolnimi pogoji (slika 2).
Obe koncentraciji DEET (10-8 M in 10-5 M) sta zmanjšali aktivnost acetilholinesteraze na HUVEC. BW284c51 (10-5 M) je bil uporabljen kot kontrola za zaviralce acetilholinesteraze. Rezultati so izraženi kot odstotek aktivnosti AChE na HUVEC, obdelanih z obema koncentracijama DEET, v primerjavi s celicami, obdelanimi z nosilcem. Vrednosti so izražene kot povprečje ± SEM šestih neodvisnih poskusov. *p < 0,05 v primerjavi s kontrolo (Kruskal-Wallisov in Dunnov test večkratne primerjave).
Dušikov oksid (NO) sodeluje v angiogenem procesu 33, zato je bila proučevana produkcija NO v celicah HUVEC, stimuliranih z DEET. Produkcija endotelijskega NO, obdelana z DEET, se je v primerjavi s kontrolnimi celicami povečala, vendar je dosegla pomembnost šele pri odmerku 10-8 M (slika 3c). Za določitev molekularnih sprememb, ki nadzorujejo produkcijo NO, inducirano z DEET, sta bili ekspresija in aktivacija eNOS analizirani z Western blot metodo. Čeprav zdravljenje z DEET ni spremenilo ekspresije eNOS, je znatno povečalo fosforilacijo eNOS na njegovem aktivacijskem mestu (Ser-1177), hkrati pa zmanjšalo njegovo inhibitorno mesto (Thr-495) v primerjavi z neobdelanimi celicami pri fosforilaciji eNOS (slika 3d). Poleg tega je bilo razmerje med fosforiliranim eNOS na aktivacijskem in inhibitornem mestu izračunano po normalizaciji količine fosforiliranega eNOS glede na skupno količino encima. To razmerje se je znatno povečalo v celicah HUVEC, obdelanih z vsako koncentracijo DEET, v primerjavi z neobdelanimi celicami (slika 3d).
Končno je bila ekspresija VEGF, enega glavnih proangiogenih faktorjev, analizirana z Western blot-om. DEET je znatno povečal ekspresijo VEGF, medtem ko je pFHHSiD to ekspresijo popolnoma blokiral.
Ker so učinki DEET-a občutljivi tako na farmakološko blokado kot na znižano regulacijo receptorjev M3, smo preizkusili hipotezo, da bi DEET lahko okrepil kalcijevo signalizacijo. Presenetljivo je, da DEET ni povečal citoplazemskega kalcija v HUVEC (podatki niso prikazani) in HEK/M3 (slika 4a, b) pri obeh uporabljenih koncentracijah.
Čas objave: 30. dec. 2024