Antihelmintik N,N-dietil-m-toluamid (DEETPoročali so, da zavira AChE (acetilholinesterazo) in ima potencialno rakotvorne lastnosti zaradi prekomerne vaskularizacije. V tem prispevku prikazujemo, da DEET posebej stimulira endotelijske celice, ki spodbujajo angiogenezo, s čimer poveča rast tumorja. DEET aktivira celične procese, ki vodijo do angiogeneze, vključno s proliferacijo, migracijo in adhezijo. To je povezano s povečano proizvodnjo NO in izražanjem VEGF v endotelijskih celicah. Utišanje M3 ali uporaba farmakoloških zaviralcev M3 je odpravilo vse te učinke, kar kaže, da je angiogeneza, ki jo povzroči DEET, občutljiva na M3. Poskusi, ki vključujejo signalizacijo kalcija v endotelijskih in HEK celicah, ki prekomerno izražajo receptorje M3, kot tudi študije vezave in priklopa kažejo, da DEET deluje kot alosterični modulator receptorjev M3. Poleg tega DEET zavira AChE, s čimer poveča biološko uporabnost acetilholina in njegovo vezavo na receptorje M3 ter poveča proangiogene učinke z alosterično regulacijo.
Primarni EC so bili izolirani iz aorte švicarskih miši. Metoda ekstrakcije je bila prilagojena iz protokola Kobayashi 26 . Mišje EC smo do četrtega prehoda gojili v mediju EBM-2, dopolnjenem s 5 % toplotno inaktiviranega FBS.
Učinek dveh koncentracij DEET na proliferacijo HUVEC, U87MG ali BF16F10 je bil analiziran z uporabo CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Na kratko, 5,103 celic na vdolbinico smo zasejali v ploščo s 96 vdolbinicami, pustili, da se je pritrdila čez noč, in nato 24 ur obdelali z DEET. Po odstranitvi rastnega medija dodajte raztopino za vezavo barvila v vsako vdolbinico mikroplošče in celice inkubirajte 30 minut pri 37 °C. Ravni fluorescence so bile določene z uporabo večmodnega bralnika mikroplošč Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemčija), opremljenega s 485 nm vzbujevalnimi filtri in 530 nm emisijskimi filtri.
HUVEC smo zasejali v plošče s 96 vdolbinicami pri gostoti 104 celic na vdolbinico. Celice smo 24 ur obdelali z DEET. Preživetje celic je bilo ocenjeno z uporabo kolorimetričnega MTT testa (Sigma-Aldrich, M5655). Vrednosti optične gostote so bile pridobljene na večmodnem bralniku mikroplošč (Mithras LB940) pri valovni dolžini 570 nm.
Učinke DEET so preučevali z in vitro angiogeneznimi testi. Zdravljenje z 10-8 M ali 10-5 M DEET je povečalo tvorbo dolžine kapilar v HUVEC (sl. 1a, b, bele črte). V primerjavi s kontrolno skupino je zdravljenje s koncentracijami DEET v razponu od 10-14 do 10-5 M pokazalo, da je dolžina kapilare dosegla plato pri 10-8 M DEET (dodatna slika S2). V in vitro proangiogenem učinku HUVEC, zdravljenih z DEET v koncentracijskem območju 10-8 M in 10-5 M, niso ugotovili pomembne razlike.
Da bi ugotovili učinek DEET na neovaskularizacijo, smo izvedli študije neovaskularizacije in vivo. Po 14 dneh so miši, ki so jim vbrizgali endotelne celice, predhodno kultivirane z 10-8 M ali 10-5 M DEET, pokazale znatno povečanje vsebnosti hemoglobina (slika 1c, bele črte).
Poleg tega so z DEET povzročeno neovaskularizacijo proučevali pri miših s ksenograftom U87MG, ki so jim dnevno (ip) injicirali DEET v odmerku, za katerega je znano, da inducira plazemske koncentracije 10-5 M, kar je normalno pri izpostavljenih ljudeh. pri 23. Zaznavne tumorje (tj. tumorje >100 mm3) so opazili 14 dni po injiciranju celic U87MG mišim. Na 28. dan je bila rast tumorja znatno povečana pri miših, zdravljenih z DEET, v primerjavi s kontrolnimi mišmi (slika 1d, kvadratki). Poleg tega je obarvanje tumorjev s CD31 pokazalo, da je DEET znatno povečal površino kapilar, ne pa tudi gostote mikrožil. (sl. 1e–g).
Za določitev vloge muskarinskih receptorjev pri proliferaciji, ki jo povzroča DETA, smo uporabili 10-8 M ali 10-5 M DETA v prisotnosti pFHHSiD (10-7 M, selektivni antagonist receptorja M3). Zdravljenje HUVEC. pFHHSiD je popolnoma blokiral proliferativne lastnosti DETA pri vseh koncentracijah (tabela 1).
Pod temi pogoji smo tudi preverili, ali bi DEET povečal dolžino kapilar v celicah HUVEC. Podobno je pFHHSiD znatno preprečil dolžino kapilar, ki jo povzroča DEET (sl. 1a, b, sive črte). Poleg tega so bili podobni poskusi izvedeni z M3 siRNA. Čeprav kontrolna siRNA ni bila učinkovita pri spodbujanju tvorbe kapilar, je utišanje muskarinskega receptorja M3 odpravilo sposobnost DEET, da poveča dolžino kapilar (sl. 1a, b, črne črte).
Poleg tega je pFHHSiD popolnoma blokiral tako 10-8 M ali 10-5 M DEET-inducirano vaskularizacijo in vitro kot neovaskularizacijo in vivo (sl. 1c, d, krogi). Ti rezultati kažejo, da DEET spodbuja angiogenezo po poti, občutljivi na selektivne antagoniste receptorjev M3 ali M3 siRNA.
AChE je molekularna tarča DEET. Zdravila, kot je donepezil, ki delujejo kot zaviralci AChE, lahko stimulirajo angiogenezo EC in vitro in na modelih ishemije zadnjih okončin miši14. Testirali smo učinek dveh koncentracij DEET na aktivnost encima AChE v HUVEC. Nizke (10-8 M) in visoke (10-5 M) koncentracije DEET so zmanjšale endotelno aktivnost AChE v primerjavi s kontrolnimi pogoji (slika 2).
Obe koncentraciji DEET (10-8 M in 10-5 M) sta zmanjšali aktivnost acetilholinesteraze na HUVEC. BW284c51 (10-5 M) smo uporabili kot kontrolo za inhibitorje acetilholinesteraze. Rezultati so izraženi kot odstotek aktivnosti AChE na HUVEC, obdelanih z dvema koncentracijama DEET, v primerjavi s celicami, obdelanimi z nosilcem. Vrednosti so izražene kot povprečje ± SEM šestih neodvisnih poskusov. *p < 0,05 v primerjavi s kontrolo (Kruskal-Wallisov in Dunnov večkratni primerjalni test).
Dušikov oksid (NO) je vključen v angiogenski proces 33, zato so preučevali proizvodnjo NO v HUVEC, stimuliranih z DEET. Proizvodnja endotelnega NO, zdravljenega z DEET, se je povečala v primerjavi s kontrolnimi celicami, vendar je dosegla pomen le pri odmerku 10-8 M (slika 3c). Za določitev molekularnih sprememb, ki nadzorujejo proizvodnjo NO, ki jo povzroča DEET, sta bili izražanje in aktivacija eNOS analizirani z Western blottingom. Čeprav zdravljenje z DEET ni spremenilo izražanja eNOS, je znatno povečalo fosforilacijo eNOS na njegovem aktivacijskem mestu (Ser-1177), medtem ko je zmanjšalo njegovo inhibitorno mesto (Thr-495) v primerjavi z neobdelanimi celicami v fosforilaciji eNOS (slika 3d). Poleg tega je bilo razmerje med fosforiliranim eNOS na aktivacijskem in inhibitornem mestu izračunano po normalizaciji količine fosforiliranega eNOS na celotno količino encima. To razmerje se je znatno povečalo pri HUVEC, zdravljenih z vsako koncentracijo DEET, v primerjavi z neobdelanimi celicami (slika 3d).
Končno je bila ekspresija VEGF, enega glavnih proangiogenih dejavnikov, analizirana z Western blottingom. DEET je znatno povečal izražanje VEGF, medtem ko je pFHHSiD to izražanje popolnoma blokiral.
Ker so učinki DEET občutljivi tako na farmakološko blokado kot na znižanje regulacije receptorjev M3, smo testirali hipotezo, da lahko DEET izboljša signalizacijo kalcija. Presenetljivo DEET ni uspel povečati citoplazemskega kalcija v HUVEC (podatki niso prikazani) in HEK/M3 (sl. 4a, b) za obe uporabljeni koncentraciji.
Čas objave: 30. december 2024