V tej študiji so bili stimulativni učinki kombiniranega zdravljenjaregulatorji rasti rastlinRaziskali so vpliv nanodelcev (2,4-D in kinetina) in železovega oksida (Fe₃O₄-NP) na morfogenezo in proizvodnjo sekundarnih metabolitov in vitro v *Hypericum perforatum* L. Optimizirana obdelava [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] je znatno izboljšala rastne parametre rastlin: višina rastline se je povečala za 59,6 %, dolžina korenin za 114,0 %, število popkov za 180,0 % in sveža teža kalusa za 198,3 % v primerjavi s kontrolno skupino. Ta kombinirana obdelava je prav tako povečala učinkovitost regeneracije (50,85 %) in povečala vsebnost hipericina za 66,6 %. Analiza GC-MS je pokazala visoko vsebnost hiperozida, β-patolena in cetilnega alkohola, ki predstavljajo 93,36 % celotne površine vrha, medtem ko se je vsebnost skupnih fenolov in flavonoidov povečala za kar 80,1 %. Ti rezultati kažejo, da regulatorji rasti rastlin (PGR) in nanodelci Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) izvajajo sinergistični učinek s spodbujanjem organogeneze in kopičenja bioaktivnih spojin, kar predstavlja obetavno strategijo za biotehnološko izboljšanje zdravilnih rastlin.
Šentjanževka (Hypericum perforatum L.), znana tudi kot šentjanževka, je trajnica iz družine Hypericaceae, ki ima gospodarsko vrednost.[1] Njene potencialne bioaktivne sestavine vključujejo naravne tanine, ksantone, floroglucinol, naftalendiantron (hiperin in psevdohiperin), flavonoide, fenolne kisline in eterična olja.[2,3,4] Šentjanževko je mogoče razmnoževati s tradicionalnimi metodami; vendar sezonskost tradicionalnih metod, nizka kalitev semen in dovzetnost za bolezni omejujejo njen potencial za gojenje v velikem obsegu in nenehno nastajanje sekundarnih metabolitov.[1,5,6]
Zato se gojenje tkiv in vitro šteje za učinkovito metodo za hitro razmnoževanje rastlin, ohranjanje virov zarodne plazme in povečan pridelek zdravilnih spojin [7, 8]. Regulatorji rasti rastlin (PGR) igrajo ključno vlogo pri uravnavanju morfogeneze in so potrebni za gojenje kalusa in celih organizmov in vitro. Optimizacija njihovih koncentracij in kombinacij je ključnega pomena za uspešen zaključek teh razvojnih procesov [9]. Zato je razumevanje ustrezne sestave in koncentracije regulatorjev pomembno za izboljšanje rasti in regenerativne sposobnosti šentjanževke (H. perforatum) [10].
Nanodelci železovega oksida (Fe₃O₄) so razred nanodelcev, ki so bili ali so v razvoju za tkivne kulture. Fe₃O₄ ima pomembne magnetne lastnosti, dobro biokompatibilnost in sposobnost spodbujanja rasti rastlin ter zmanjševanja okoljskega stresa, zato je pritegnil veliko pozornosti pri načrtovanju tkivnih kultur. Potencialne uporabe teh nanodelcev lahko vključujejo optimizacijo in vitro kulture za spodbujanje delitve celic, izboljšanje privzema hranil in aktiviranje antioksidativnih encimov [11].
Čeprav so nanodelci pokazali dobre spodbudne učinke na rast rastlin, je študij o kombinirani uporabi nanodelcev Fe₃O₄ in optimiziranih regulatorjev rasti rastlin pri *H. perforatum* še vedno malo. Da bi zapolnili to vrzel v znanju, je ta študija ocenila učinke njihovih kombiniranih učinkov na morfogenezo in vitro in proizvodnjo sekundarnih metabolitov, da bi zagotovila nove vpoglede v izboljšanje značilnosti zdravilnih rastlin. Zato ima ta študija dva cilja: (1) optimizirati koncentracijo regulatorjev rasti rastlin za učinkovito spodbujanje nastajanja kalusa, regeneracije poganjkov in ukoreninjenja in vitro; in (2) oceniti učinke nanodelcev Fe₃O₄ na parametre rasti in vitro. Prihodnji načrti vključujejo oceno stopnje preživetja regeneriranih rastlin med aklimatizacijo (in vitro). Pričakuje se, da bodo rezultati te študije znatno izboljšali učinkovitost mikrorazmnoževanja *H. perforatum* in s tem prispevali k trajnostni uporabi in biotehnološki uporabi te pomembne zdravilne rastline.
V tej študiji smo pridobili listne eksplantate enoletnih rastlin šentjanževke (matičnih rastlin), vzgojenih na polju. Te eksplantate smo uporabili za optimizacijo pogojev gojenja in vitro. Pred gojenjem smo liste nekaj minut temeljito sprali pod tekočo destilirano vodo. Površine eksplantatov smo nato razkužili s 30-sekundno potapljanjem v 70 % etanol, nato pa s 10-minutno potapljanjem v 1,5 % raztopino natrijevega hipoklorita (NaOCl), ki je vsebovala nekaj kapljic Tween 20. Na koncu smo eksplantate trikrat sprali s sterilno destilirano vodo, preden smo jih prenesli v naslednji gojišče.
V naslednjih štirih tednih so merili parametre regeneracije poganjkov, vključno s hitrostjo regeneracije, številom poganjkov na eksplant in dolžino poganjka. Ko so regenerirani poganjki dosegli dolžino vsaj 2 cm, so jih prenesli v gojišče za ukoreninjenje, ki je vsebovalo polovično koncentrirano gojišče MS, 0,5 mg/L indolmaslene kisline (IBA) in 0,3 % guar gumija. Gojenje ukoreninjenja je trajalo tri tedne, v tem času pa so merili hitrost ukoreninjenja, število korenin in dolžino korenin. Vsako tretiranje so ponovili trikrat, pri čemer je bilo na ponovitev gojenih 10 eksplantov, kar je dalo približno 30 eksplantov na tretiranje.
Višino rastline so z ravnilom izmerili v centimetrih (cm), od dna rastline do vrha najvišjega lista. Dolžino korenine so v milimetrih (mm) izmerili takoj po previdni odstranitvi sadik in rastnega substrata. Število popkov na eksplant je bilo prešteto neposredno na vsaki rastlini. Število črnih pik na listih, znanih kot vozlički, so izmerili vizualno. Domneva se, da so ti črni vozlički žleze, ki vsebujejo hipericin, ali oksidativne pege in se uporabljajo kot fiziološki indikator odziva rastline na tretiranje. Po odstranitvi vsega rastnega substrata je bila sveža teža sadik izmerjena z elektronsko tehtnico z natančnostjo miligramov (mg).
Metoda za izračun hitrosti nastajanja kalusa je naslednja: po štiritedenskem gojenju eksplantatov v gojišču, ki vsebuje različne rastne regulatorje (kinaze, 2,4-D in Fe3O4), se prešteje število eksplantatov, ki so sposobni tvoriti kalus. Formula za izračun hitrosti nastajanja kalusa je naslednja:
Vsako tretiranje smo ponovili trikrat, pri čemer smo v vsaki ponovitvi pregledali vsaj 10 eksplantov.
Stopnja regeneracije odraža delež kalusnega tkiva, ki uspešno zaključi proces diferenciacije popkov po fazi nastanka kalusa. Ta kazalnik prikazuje sposobnost kalusnega tkiva, da se preoblikuje v diferencirano tkivo in zraste v nove rastlinske organe.
Koeficient ukoreninjenja je razmerje med številom vej, ki se lahko ukoreninijo, in skupnim številom vej. Ta kazalnik odraža uspešnost faze ukoreninjenja, ki je ključnega pomena pri mikrorazmnoževanju in razmnoževanju rastlin, saj dobro ukoreninjenje pomaga sadikam, da bolje preživijo v rastnih razmerah.
Hipericinske spojine smo ekstrahirali z 90 % metanolom. Petdeset mg posušenega rastlinskega materiala smo dodali 1 ml metanola in sonificirali 20 minut pri 30 kHz v ultrazvočnem čistilcu (model A5120-3YJ) pri sobni temperaturi v temi. Po sonikaciji smo vzorec centrifugirali 15 minut pri 6000 vrt/min. Supernatant smo zbrali in izmerili absorbanco hipericina pri 592 nm s spektrofotometrom Plus-3000 S po metodi, ki so jo opisali Conceiçao in sod. [14].
Večina tretmajev z regulatorji rasti rastlin (PGR) in nanodelci železovega oksida (Fe₃O₄-NP) ni povzročila nastanka črnih vozličkov na regeneriranih listih poganjkov. Pri nobenem od tretmajev z 0,5 ali 1 mg/L 2,4-D, 0,5 ali 1 mg/L kinetina ali 1, 2 ali 4 mg/L nanodelcev železovega oksida niso opazili vozličkov. Nekaj kombinacij je pokazalo rahlo povečanje razvoja vozličkov (vendar ne statistično značilno) pri višjih koncentracijah kinetina in/ali nanodelcev železovega oksida, kot je kombinacija 2,4-D (0,5–2 mg/L) s kinetinom (1–1,5 mg/L) in nanodelci železovega oksida (2–4 mg/L). Ti rezultati so prikazani na sliki 2. Črni vozlički predstavljajo žleze, bogate s hipericinom, ki so tako naravne kot koristne. V tej študiji so bili črni vozlički povezani predvsem s porjavitvijo tkiv, kar kaže na ugodno okolje za kopičenje hipericina. Obdelava z nanodelci 2,4-D, kinetina in Fe₃O₄ je spodbudila rast kalusa, zmanjšala porjavitev in povečala vsebnost klorofila, kar kaže na izboljšano presnovno funkcijo in potencialno zmanjšanje oksidativne škode [37]. Ta študija je ocenila učinke kinetina v kombinaciji z nanodelci 2,4-D in Fe₃O₄ na rast in razvoj kalusa šentjanževke (slika 3a–g). Prejšnje študije so pokazale, da imajo nanodelci Fe₃O₄ protiglivično in protimikrobno delovanje [38, 39] in da lahko v kombinaciji z regulatorji rasti rastlin spodbudijo obrambne mehanizme rastlin in zmanjšajo indekse celičnega stresa [18]. Čeprav je biosinteza sekundarnih metabolitov genetsko regulirana, je njihov dejanski pridelek zelo odvisen od okoljskih razmer. Presnovne in morfološke spremembe lahko vplivajo na raven sekundarnih metabolitov z uravnavanjem izražanja specifičnih rastlinskih genov in odzivanjem na okoljske dejavnike. Poleg tega lahko induktorji sprožijo aktivacijo novih genov, ki nato spodbujajo encimsko aktivnost, kar na koncu aktivira več biosintetskih poti in vodi do nastanka sekundarnih metabolitov. Poleg tega je druga študija pokazala, da zmanjšanje senčenja poveča izpostavljenost sončni svetlobi, s čimer se zvišajo dnevne temperature v naravnem habitatu *Hypericum perforatum*, kar prav tako prispeva k povečanemu donosu hipericina. Na podlagi teh podatkov je ta študija raziskala vlogo železovih nanodelcev kot potencialnih induktorjev v tkivnih kulturah. Rezultati so pokazali, da lahko ti nanodelci aktivirajo gene, ki sodelujejo pri biosintezi hesperidina, z encimsko stimulacijo, kar vodi do povečanega kopičenja te spojine (slika 2). Zato lahko v primerjavi z rastlinami, ki rastejo v naravnih pogojih, trdimo, da se lahko proizvodnja takšnih spojin in vivo poveča tudi, če se zmeren stres kombinira z aktivacijo genov, ki sodelujejo pri biosintezi sekundarnih metabolitov. Kombinirana zdravljenja imajo na splošno pozitiven učinek na hitrost regeneracije, v nekaterih primerih pa je ta učinek oslabljen. Predvsem zdravljenje z 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinaze in različnimi koncentracijami lahko neodvisno in znatno poveča hitrost regeneracije za 50,85 % v primerjavi s kontrolno skupino (slika 4c). Ti rezultati kažejo, da lahko specifične kombinacije nanohormonov delujejo sinergistično za spodbujanje rasti rastlin in proizvodnje metabolitov, kar je zelo pomembno za tkivne kulture zdravilnih rastlin. Palmer in Keller [50] sta pokazala, da lahko obdelava z 2,4-D neodvisno povzroči nastanek kalusa pri St. perforatum, medtem ko dodatek kinaze znatno poveča nastanek in regeneracijo kalusa. Ta učinek je bil posledica izboljšanja hormonskega ravnovesja in spodbujanja delitve celic. Bal in sod. [51] so ugotovili, da lahko obdelava z Fe₃O₄-NP neodvisno okrepi delovanje antioksidativnih encimov in s tem spodbudi rast korenin pri St. perforatum. Gojišča, ki vsebujejo nanodelce Fe₃O₄ v koncentracijah 0,5 mg/L, 1 mg/L in 1,5 mg/L, so izboljšala hitrost regeneracije lanenih rastlin [52]. Uporaba kinetina, 2,4-diklorobenzotiazolinona in nanodelcev Fe₃O₄ je znatno izboljšala hitrost nastajanja kalusa in korenin, vendar je treba upoštevati morebitne stranske učinke uporabe teh hormonov za regeneracijo in vitro. Na primer, dolgotrajna ali visoko koncentrirana uporaba 2,4-diklorobenzotiazolinona ali kinetina lahko povzroči somatsko klonsko variacijo, oksidativni stres, nenormalno morfologijo kalusa ali vitrifikacijo. Zato visoka stopnja regeneracije ne napoveduje nujno genetske stabilnosti. Vse regenerirane rastline je treba oceniti z uporabo molekularnih markerjev (npr. RAPD, ISSR, AFLP) ali citogenetske analize, da se ugotovi njihova homogenost in podobnost z rastlinami in vivo [53,54,55].
Ta študija je prvič pokazala, da lahko kombinirana uporaba regulatorjev rasti rastlin (2,4-D in kinetina) z nanodelci Fe₃O₄ izboljša morfogenezo in kopičenje ključnih bioaktivnih metabolitov (vključno s hipericinom in hiperozidom) v *Hypericum perforatum*. Optimiziran režim tretiranja (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetina + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) ni le povečal nastajanja kalusa, organogeneze in donosa sekundarnih metabolitov, temveč je pokazal tudi blag indukcijski učinek, ki lahko izboljša odpornost rastline na stres in njeno medicinsko vrednost. Kombinacija nanotehnologije in kulture rastlinskih tkiv zagotavlja trajnostno in učinkovito platformo za obsežno in vitro proizvodnjo zdravilnih spojin. Ti rezultati utirajo pot industrijskim aplikacijam in prihodnjim raziskavam molekularnih mehanizmov, optimizacije odmerjanja in genetske natančnosti, s čimer povezujejo temeljne raziskave zdravilnih rastlin s praktično biotehnologijo.
Čas objave: 12. dec. 2025