Rast apikalnega meristema poganjka (SAM) je kritična za arhitekturo stebla. Rastlinski hormonigiberelini(GA) igrajo ključno vlogo pri usklajevanju rasti rastlin, vendar je njihova vloga v SAM še vedno slabo razumljena. Tu smo razvili raciometrični biosenzor signalizacije GA z inženiringom proteina DELLA, da zatre njegovo bistveno regulativno funkcijo v transkripcijskem odzivu GA, hkrati pa ohrani njegovo razgradnjo po prepoznavanju GA. Dokazujemo, da ta biosenzor, ki temelji na razgradnji, natančno beleži spremembe ravni GA in celičnega zaznavanja med razvojem. Ta biosenzor smo uporabili za preslikavo signalne aktivnosti GA v SAM. Pokazali smo, da so visoki signali GA prisotni predvsem v celicah, ki se nahajajo med primordijami organov, ki so predhodniki internodnih celic. Z uporabo pristopov pridobivanja in izgube funkcije nadalje dokazujemo, da GA uravnava orientacijo ravnine celične delitve, vzpostavlja kanonično celično organizacijo internodijev, s čimer spodbuja specifikacijo internodijev v SAM.
Apikalni meristem poganjka (SAM), ki se nahaja na vrhu poganjka, vsebuje nišo matičnih celic, katerih aktivnost ustvarja stranske organe in stebelne vozle na modularen in ponavljajoč se način skozi celotno življenjsko dobo rastline. Vsaka od teh ponavljajočih se enot ali rastlinskih vozlišč vključuje internodije in stranske organe v vozliščih ter aksilarne meristeme v pazduhah listov1. Rast in organizacija rastlinskih vozlov se med razvojem spreminjata. Pri Arabidopsisu je internodalna rast med vegetativno fazo potlačena, aksilarni meristemi pa ostanejo mirujoči v pazduhah listov rozete. Med prehodom v cvetno fazo SAM postane meristem socvetja, ki ustvari podolgovate internodije in aksilarne popke, vejice v pazduhah stebnih listov in kasneje brezlistne cvetove2. Čeprav smo dosegli pomemben napredek pri razumevanju mehanizmov, ki nadzorujejo iniciacijo listov, cvetov in vej, je relativno malo znanega o tem, kako nastanejo internodije.
Razumevanje prostorsko-časovne porazdelitve GA bo pomagalo bolje razumeti funkcije teh hormonov v različnih tkivih in na različnih razvojnih stopnjah. Vizualizacija degradacije fuzije RGA-GFP, izražene pod delovanjem lastnega promotorja, zagotavlja pomembne informacije o regulaciji skupnih ravni GA v koreninah15,16. Vendar se izražanje RGA razlikuje med tkivi17 in ga uravnava GA18. Tako lahko diferencialna ekspresija promotorja RGA povzroči vzorec fluorescence, opažen z RGA-GFP, zato ta metoda ni kvantitativna. Pred kratkim je bioaktivni fluorescein (Fl) označen GA19, 20 razkril kopičenje GA v koreninskem endokorteksu in regulacijo njegovih celičnih ravni s transportom GA. Nedavno je senzor GA FRET nlsGPS1 pokazal, da ravni GA korelirajo z raztezkom celic v koreninah, filamentih in temno rastlih hipokotilih21. Vendar, kot smo videli, koncentracija GA ni edini parameter, ki nadzoruje aktivnost signalizacije GA, saj je odvisna od kompleksnih procesov zaznavanja. Tukaj, na podlagi našega razumevanja signalnih poti DELLA in GA, poročamo o razvoju in karakterizaciji raciometričnega biosenzorja, ki temelji na razgradnji, za signalizacijo GA. Za razvoj tega kvantitativnega biosenzorja smo uporabili mutant RGA, občutljiv na GA, ki je bil spojen s fluorescentnim proteinom in vseprisotno izražen v tkivih, kot tudi fluorescenčni protein, neobčutljiv na GA. Pokažemo, da mutantne fuzije beljakovin RGA ne motijo endogenega signaliziranja GA, ko so vseprisotno izražene, in da lahko ta biosenzor količinsko opredeli signalno aktivnost, ki izhaja iz vnosa GA in obdelave signala GA s senzorskim aparatom z visoko prostorsko-časovno ločljivostjo. Ta biosenzor smo uporabili za preslikavo prostorsko-časovne porazdelitve signalne aktivnosti GA in kvantificirali, kako GA uravnava celično vedenje v povrhnjici SAM. Dokazujemo, da GA uravnava orientacijo delitvene ravnine celic SAM, ki se nahajajo med primordijami organov, s čimer definira kanonično celično organizacijo internodija.
Na koncu smo vprašali, ali lahko qmRGA poroča o spremembah endogenih ravni GA z uporabo rastočih hipokotilov. Prej smo pokazali, da nitrat spodbuja rast s povečanjem sinteze GA in posledično razgradnjo DELLA34. V skladu s tem smo opazili, da je bila dolžina hipokotila pri sadikih pUBQ10 :: qmRGA, gojenih v obilni oskrbi z nitrati (10 mM NO3-), bistveno daljša od tiste pri sadikih, gojenih v pogojih s pomanjkanjem nitratov (dopolnilna slika 6a). V skladu z odzivom rasti so bili signali GA višji v hipokotilih sadik, gojenih pod pogoji 10 mM NO3-, kot pri sadikah, gojenih v odsotnosti nitrata (dodatna slika 6b, c). Tako qmRGA omogoča tudi spremljanje sprememb v signalizaciji GA, ki jih povzročajo endogene spremembe koncentracije GA.
Da bi razumeli, ali je signalna aktivnost GA, ki jo zazna qmRGA, odvisna od koncentracije GA in zaznavanja GA, kot je bilo pričakovano glede na zasnovo senzorja, smo analizirali izražanje treh receptorjev GID1 v vegetativnih in reproduktivnih tkivih. Pri sadikah je reporterska linija GID1-GUS pokazala, da sta bila GID1a in c močno izražena v kličnih listih (sl. 3a–c). Poleg tega so bili vsi trije receptorji izraženi v listih, stranskih koreninskih primordijih, koreninskih konicah (razen koreninske kapice GID1b) in vaskularnem sistemu (sl. 3a–c). V socvetju SAM smo zaznali signale GUS samo za GID1b in 1c (dodatna slika 7a–c). Hibridizacija in situ je potrdila te vzorce ekspresije in nadalje pokazala, da je bil GID1c enakomerno izražen na nizkih ravneh v SAM, medtem ko je GID1b pokazal višjo ekspresijo na obrobju SAM (dodatna slika 7d–l). Translacijska fuzija pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b je razkrila tudi stopenjsko območje ekspresije GID1b, od nizke ali nič ekspresije v središču SAM do visoke ekspresije na mejah organov (dodatna slika 7m). Tako receptorji GID1 niso enakomerno porazdeljeni po in znotraj tkiv. V naslednjih poskusih smo opazili tudi, da je čezmerna ekspresija GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) povečala občutljivost qmRGA v hipokotilih na zunanjo aplikacijo GA (sl. 3d, e). Nasprotno pa je bila fluorescenca, izmerjena s qd17mRGA v hipokotilu, neobčutljiva na zdravljenje z GA3 (sl. 3f, g). Za oba testa so bile sadike obdelane z visokimi koncentracijami GA (100 μM GA3), da bi ocenili hitro obnašanje senzorja, kjer je bila sposobnost vezave na receptor GID1 povečana ali izgubljena. Ti rezultati skupaj potrjujejo, da biosenzor qmRGA služi kombinirani funkciji kot senzor GA in GA, in kažejo, da lahko diferencialna ekspresija receptorja GID1 znatno modulira emisivnost senzorja.
Do danes ostaja porazdelitev signalov GA v SAM nejasna. Zato smo uporabili rastline, ki izražajo qmRGA, in poročevalec izvornih celic pCLV3 :: mCherry-NLS35 za izračun kvantitativnih zemljevidov visoke ločljivosti signalne aktivnosti GA, s poudarkom na sloju L1 (povrhnjica; slika 4a, b, glejte metode in dopolnilne metode), saj ima L1 ključno vlogo pri nadzoru rasti SAM36. Tukaj je izraz pCLV3 :: mCherry-NLS zagotovil fiksno geometrijsko referenčno točko za analizo prostorsko-časovne porazdelitve signalne aktivnosti GA37. Čeprav se GA šteje za bistvenega pomena za razvoj stranskih organov4, smo opazili, da so bili signali GA nizki v cvetličnem primordiju (P), začenši s stopnjo P3 (sl. 4a, b), medtem ko so imeli mladi primordiji P1 in P2 zmerno aktivnost, podobno tisti v osrednji regiji (sl. 4a, b). Višja signalna aktivnost GA je bila odkrita na mejah primordija organa, začenši pri P1/P2 (ob straneh meje) in dosegla vrh pri P4, kot tudi v vseh celicah periferne regije, ki se nahaja med primordijem (sl. 4a, b in dopolnilna slika 8a, b). Ta višja signalna aktivnost GA je bila opažena ne samo v povrhnjici, temveč tudi v L2 in zgornji L3 plasti (dopolnilna slika 8b). Tudi vzorec signalov GA, odkritih v SAM z uporabo qmRGA, je sčasoma ostal nespremenjen (dodatna slika 8c–f, k). Čeprav je bil konstrukt qd17mRGA sistematično znižan v SAM rastlin T3 iz petih neodvisnih linij, ki smo jih podrobno opisali, smo lahko analizirali fluorescenčne vzorce, dobljene s konstruktom pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP (dodatna slika 8g–j, l). V tej kontrolni liniji so bile v SAM odkrite le manjše spremembe v razmerju fluorescence, vendar smo v centru SAM opazili jasno in nepričakovano zmanjšanje VENUS, povezanega s TagBFP. To potrjuje, da signalni vzorec, ki ga opazi qmRGA, odraža od GA odvisno degradacijo mRGA-VENUS, vendar tudi dokazuje, da lahko qmRGA preceni signalno aktivnost GA v meristemskem središču. Če povzamemo, naši rezultati razkrivajo vzorec signalizacije GA, ki odraža predvsem porazdelitev primordijev. Ta porazdelitev inter-primordialne regije (IPR) je posledica postopnega vzpostavljanja visoke signalne aktivnosti GA med razvijajočim se primordijem in osrednjo regijo, medtem ko se istočasno signalna aktivnost GA v primordiju zmanjša (sl. 4c, d).
Porazdelitev receptorjev GID1b in GID1c (glej zgoraj) kaže, da diferencialna ekspresija receptorjev GA pomaga oblikovati vzorec aktivnosti signalizacije GA v SAM. Spraševali smo se, ali bi lahko prišlo do diferencialnega kopičenja GA. Za raziskavo te možnosti smo uporabili senzor nlsGPS1 GA FRET21. V SAM nlsGPS1, obdelanega z 10 μM GA4+7 100 minut, smo zaznali povečano frekvenco aktivacije (dodatna slika 9a–e), kar kaže, da se nlsGPS1 odziva na spremembe koncentracije GA v SAM, tako kot v koreninah21. Prostorska porazdelitev frekvence aktivacije nlsGPS1 je pokazala relativno nizke ravni GA v zunanjih plasteh SAM, vendar je pokazala, da so povišane v središču in na robovih SAM (slika 4e in dodatna slika 9a,c). To kaže, da je GA tudi v SAM porazdeljena s prostorskim vzorcem, primerljivim s tistim, ki ga je pokazal qmRGA. Kot dopolnilni pristop smo SAM obdelali tudi s fluorescentnim GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ali samo s Fl kot negativno kontrolo. Signal Fl je bil porazdeljen po celotnem SAM, vključno z osrednjim območjem in primordijem, čeprav z nižjo intenzivnostjo (slika 4j in dopolnilna slika 10d). Nasprotno pa so se vsi trije GA-Fl kopičili specifično znotraj meja primordija in v različni meri v preostalem IPR, pri čemer se je GA7-Fl kopičil v največji domeni v IPR (slika 4k in dopolnilna slika 10a,b). Kvantifikacija intenzivnosti fluorescence je pokazala, da je bilo razmerje med intenzivnostjo IPR in ne-IPR višje v SAM, obdelanem z GA-Fl, v primerjavi s SAM, obdelanim s Fl (slika 4l in dopolnilna slika 10c). Ti rezultati skupaj kažejo, da je GA prisoten v višjih koncentracijah v celicah IPR, ki se nahajajo najbližje meji organa. To kaže, da vzorec signalne aktivnosti SAM GA izhaja tako iz diferencialne ekspresije receptorjev GA kot iz diferencialne akumulacije GA v celicah IPR blizu meja organov. Naša analiza je tako razkrila nepričakovan prostorsko-časovni vzorec signalizacije GA, z nižjo aktivnostjo v središču in primordiju SAM ter višjo aktivnostjo v IPR v periferni regiji.
Da bi razumeli vlogo diferencialne signalne aktivnosti GA v SAM, smo analizirali korelacijo med signalno aktivnostjo GA, celično ekspanzijo in delitvijo celic z uporabo slikanja v realnem času v časovnem zamiku SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Glede na vlogo GA pri regulaciji rasti je bila pričakovana pozitivna korelacija s parametri celične ekspanzije. Zato smo najprej primerjali zemljevide signalne aktivnosti GA z zemljevidi stopnje rasti celične površine (kot približek za moč celične ekspanzije za dano celico in za hčerinske celice pri delitvi) in z zemljevidi anizotropije rasti, ki meri usmerjenost celične ekspanzije (tudi tukaj uporabljena za dano celico in za hčerinske celice pri delitvi; slika 5a, b, glejte metode in dopolnilne metode). Naši zemljevidi stopnje rasti celične površine SAM so skladni s prejšnjimi opažanji 38, 39, z minimalnimi stopnjami rasti na meji in največjimi stopnjami rasti v razvijajočih se cvetovih (slika 5a). Analiza glavnih komponent (PCA) je pokazala, da je bila signalna aktivnost GA v negativni korelaciji z intenzivnostjo rasti celične površine (slika 5c). Pokazali smo tudi, da so bile glavne osi variacije, vključno z vnosom signala GA in intenzivnostjo rasti, pravokotne na smer, ki jo določa visoka ekspresija CLV3, kar potrjuje izključitev celic iz centra SAM v preostalih analizah. Spearmanova korelacijska analiza je potrdila rezultate PCA (slika 5d), kar kaže, da višji signali GA v IPR niso povzročili večje celične ekspanzije. Vendar pa je korelacijska analiza pokazala rahlo pozitivno korelacijo med signalno aktivnostjo GA in anizotropijo rasti (slika 5c, d), kar kaže, da višja signalizacija GA v IPR vpliva na smer rasti celic in morda na položaj ravnine celične delitve.
a, b Toplotni zemljevidi povprečne rasti površine (a) in anizotropije rasti (b) v SAM v povprečju sedmih neodvisnih rastlin (uporabljajo se kot približki za moč in smer širjenja celic). c Analiza PCA je vključevala naslednje spremenljivke: signal GA, intenzivnost površinske rasti, anizotropijo površinske rasti in izražanje CLV3. PCA komponenta 1 je bila večinoma negativno povezana z intenzivnostjo površinske rasti in pozitivno povezana s signalom GA. Komponenta PCA 2 je bila večinoma pozitivno povezana z anizotropijo rasti površine in negativno povezana z izražanjem CLV3. Odstotki predstavljajo variacijo, ki jo pojasnjuje vsaka komponenta. d Spearmanova korelacijska analiza med signalom GA, intenzivnostjo rasti površine in anizotropijo rasti površine na lestvici tkiva brez CZ. Številka na desni je Spearmanova vrednost rho med dvema spremenljivkama. Zvezdice označujejo primere, kjer je korelacija/negativna korelacija zelo pomembna. e 3D vizualizacija celic Col-0 SAM L1 s konfokalno mikroskopijo. Nove celične stene, oblikovane v SAM (vendar ne primordij) po 10 urah, so obarvane glede na njihove vrednosti kota. Barvna vrstica je prikazana v spodnjem desnem kotu. Vložek prikazuje ustrezno 3D sliko pri 0 h. Poskus je bil ponovljen dvakrat s podobnimi rezultati. f Škatle prikazujejo stopnje delitve celic v IPR in ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 neodvisnih rastlin). Sredinska črta prikazuje mediano, meje polja pa 25. in 75. percentil. Brki označujejo najmanjšo in največjo vrednost, določeno s programsko opremo R. Vrednosti P so bile pridobljene z Welchovim dvostranskim t-testom. g, h Shematski diagram, ki prikazuje (g) kako izmeriti kot nove celične stene (magenta) glede na radialno smer od središča SAM (bela pikčasta črta) (upoštevane so le vrednosti ostrega kota, tj. 0–90°), in (h) obodne/stranske in radialne smeri znotraj meristema. i Frekvenčni histogrami usmerjenosti ravnine celične delitve čez SAM (temno modra), IPR (srednje modra) oziroma ne-IPR (svetlo modra). Vrednosti P so bile pridobljene z dvostranskim Kolmogorov-Smirnovim testom. Poskus je bil ponovljen dvakrat s podobnimi rezultati. j Frekvenčni histogrami orientacije celične delitvene ravnine IPR okoli P3 (svetlo zelena), P4 (srednje zelena) oziroma P5 (temno zelena). Vrednosti P so bile pridobljene z dvostranskim Kolmogorov-Smirnovim testom. Poskus je bil ponovljen dvakrat s podobnimi rezultati.
Zato smo nato raziskali korelacijo med signalizacijo GA in aktivnostjo celične delitve z identifikacijo na novo oblikovanih celičnih sten med testom (slika 5e). Ta pristop nam je omogočil merjenje frekvence in smeri celične delitve. Presenetljivo smo ugotovili, da je bila pogostost celičnih delitev v IPR in preostalem delu SAM (ne-IPR, slika 5f) podobna, kar kaže, da razlike v signalizaciji GA med celicami IPR in ne-IPR ne vplivajo bistveno na celično delitev. To in pozitivna korelacija med signaliziranjem GA in anizotropijo rasti nas je spodbudilo, da razmislimo, ali bi lahko signalna aktivnost GA vplivala na orientacijo ravnine celične delitve. Izmerili smo orientacijo nove celične stene kot oster kot glede na radialno os, ki povezuje središče meristema in središče nove celične stene (sl. 5e-i) in opazili jasno težnjo, da se celice delijo pod kotom blizu 90° glede na radialno os, z najvišjimi frekvencami, opaženimi pri 70–80° (23,28 %) in 80–90°. (22,62 %) (sl. 5e, i), kar ustreza celičnim delitvam v obodni/prečni smeri (sl. 5h). Da bi preučili prispevek signalizacije GA k temu obnašanju celične delitve, smo ločeno analizirali parametre celične delitve v IPR in ne-IPR (slika 5i). Opazili smo, da se porazdelitev kota delitve v celicah IPR razlikuje od porazdelitve v celicah brez IPR ali v celicah v celotnem SAM, pri čemer imajo celice IPR večji delež stranskih/krožnih celičnih delitev, tj. 70–80° in 80–90° (33,86 % oziroma 30,71 %, ustrezna razmerja) (slika 5i). Tako so naša opazovanja pokazala povezavo med visoko signalizacijo GA in usmerjenostjo ravnine celične delitve blizu obodne smeri, podobno korelaciji med signalno aktivnostjo GA in anizotropijo rasti (sl. 5c, d). Za nadaljnjo vzpostavitev prostorskega ohranjanja te povezave smo izmerili usmerjenost delitvene ravnine v celicah IPR, ki obkrožajo primordij, začenši s P3, saj je bila najvišja signalna aktivnost GA zaznana v tej regiji, začenši s P4 (slika 4). Delitveni koti IPR okoli P3 in P4 niso pokazali statistično značilnih razlik, čeprav so v IPR okoli P4 opazili povečano pogostnost stranskih delitev celic (slika 5j). Vendar pa je v celicah IPR okoli P5 razlika v orientaciji ravnine celične delitve postala statistično značilna, z močnim povečanjem frekvence prečnih delitev celic (slika 5j). Ti rezultati skupaj kažejo, da lahko signalizacija GA nadzoruje orientacijo celičnih delitev v SAM, kar je skladno s prejšnjimi poročili 40, 41, da lahko visoka signalizacija GA inducira lateralno orientacijo celičnih delitev v IPR.
Predvideva se, da celice v IPR ne bodo vključene v primordije, temveč v internodije 2, 42, 43. Prečna usmeritev celičnih delitev v IPR lahko povzroči tipično organizacijo vzporednih vzdolžnih vrst epidermalnih celic v internodijih. Naša opažanja, opisana zgoraj, kažejo, da signalizacija GA verjetno igra vlogo v tem procesu z uravnavanjem smeri delitve celic.
Izguba delovanja več genov DELLA povzroči konstitutivni odziv GA in della mutante lahko uporabimo za testiranje te hipoteze44. Najprej smo analizirali vzorce izražanja petih DELLA genov v SAM. Transkripcijska fuzija linije GUS45 je pokazala, da so bili GAI, RGA, RGL1 in RGL2 (v veliko manjši meri) izraženi v SAM (dodatna slika 11a–d). Hibridizacija in situ je nadalje pokazala, da se mRNA GAI kopiči posebej v primordijih in cvetovih v razvoju (dopolnilna slika 11e). RGL1 in RGL3 mRNA sta bili odkriti v celotni krošnji SAM in v starejših cvetovih, medtem ko je bila mRNA RGL2 večja v mejni regiji (dopolnilna slika 11f-h). Konfokalno slikanje pRGL3 :: RGL3-GFP SAM je potrdilo izražanje, opaženo s hibridizacijo in situ, in pokazalo, da se protein RGL3 kopiči v osrednjem delu SAM (dopolnilna slika 11i). Z uporabo linije pRGA :: GFP-RGA smo tudi ugotovili, da se RGA protein kopiči v SAM, vendar se njegova številčnost zmanjša na meji, začenši s P4 (dodatna slika 11j). Predvsem so vzorci izražanja RGL3 in RGA skladni z večjo signalno aktivnostjo GA v IPR, kot je zaznal qmRGA (slika 4). Poleg tega ti podatki kažejo, da so vse DELLA izražene v SAM in da njihov izraz skupaj zajema celoten SAM.
Nato smo analizirali parametre celične delitve v divjem tipu SAM (Ler, kontrola) in gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globalnih) mutantov (sl. 6a, b). Zanimivo je, da smo opazili statistično značilen premik v porazdelitvi frekvenc kota celične delitve v mutantnem SAM della global v primerjavi z divjim tipom (slika 6c). Ta sprememba v mutantu della global je bila posledica povečanja pogostosti kotov 80–90° (34,71% v primerjavi z 24,55%) in v manjši meri kotov 70–80° (23,78% v primerjavi z 20,18%), tj., kar ustreza prečnim delitvam celic (slika 6c). Pogostost neprečnih delitev (0–60°) je bila prav tako nižja pri mutantu della global (slika 6c). Pogostost prečnih celičnih delitev je bila znatno povečana v SAM mutanta della global (slika 6b). Pogostost prečnih celičnih delitev v IPR je bila prav tako višja pri mutantu della global v primerjavi z divjim tipom (slika 6d). Zunaj regije IPR je imel divji tip bolj enakomerno porazdelitev kotov celične delitve, medtem ko je della globalni mutant dal prednost tangencialnim delitvam, kot je IPR (slika 6e). Kvantificirali smo tudi orientacijo celičnih delitev v SAM petkratnih mutantov ga2 oksidaze (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 in ga2ox6-2), GA-neaktivnega mutantnega ozadja, v katerem se kopiči GA. V skladu s povečanjem ravni GA je bil SAM petkratnega ga2ox mutantnega socvetja večji kot pri Col-0 (dodatna slika 12a, b), v primerjavi s Col-0 pa je petkratni ga2ox SAM pokazal izrazito drugačno porazdelitev kotov celične delitve, pri čemer se je frekvenca kota povečala od 50° do 90°, tj. spet v korist tangencialne delitve (dodatna slika 12a–c). Tako smo pokazali, da konstitutivna aktivacija signalizacije GA in kopičenje GA inducirata stranske delitve celic v IPR in preostalem delu SAM.
a, b 3D vizualizacija plasti L1 PI-obarvanega Ler (a) in globalnega della mutanta (b) SAM z uporabo konfokalne mikroskopije. Nove celične stene, ki so nastale v SAM (vendar ne primordiju) v 10-urnem obdobju, so prikazane in obarvane glede na njihove vrednosti kota. Vložek prikazuje SAM ob 0 h. Barvna vrstica je prikazana v spodnjem desnem kotu. Puščica v (b) kaže na primer poravnanih celičnih datotek v globalnem della mutantu. Poskus je bil ponovljen dvakrat s podobnimi rezultati. ce primerjava frekvenčne porazdelitve orientacije celične delitvene ravnine v celotnem SAM (d), IPR (e) in ne-IPR (f) med Ler in global della. Vrednosti P so bile pridobljene z uporabo dvostranskega Kolmogorov-Smirnovega testa. f, g 3D vizualizacija konfokalnih slik PI-obarvanega SAM transgenih rastlin Col-0 (i) in pCUC2::gai-1-VENUS (j). Plošče (a, b) prikazujejo nove celične stene (vendar ne primordije), nastale v SAM v 10 urah. Poskus je bil ponovljen dvakrat s podobnimi rezultati. h–j Primerjava frekvenčne porazdelitve orientacije ravnine celične delitve v celotnem SAM (h), IPR (i) in ne-IPR (j) med rastlinami Col-0 in pCUC2::gai-1-VENUS. Vrednosti P so bile pridobljene z uporabo dvostranskega Kolmogorov–Smirnovega testa.
Nato smo preizkusili učinek zaviranja signalizacije GA posebej v IPR. V ta namen smo uporabili promotor klične skodelice 2 (CUC2) za spodbujanje izražanja dominantnega negativnega proteina gai-1, spojenega z VENUS (v liniji pCUC2::gai-1-VENUS). V divjem tipu SAM spodbuja promotor CUC2 izražanje večine IPR v SAM, vključno z mejnimi celicami, od P4 naprej, podobno specifično izražanje pa so opazili v rastlinah pCUC2::gai-1-VENUS (glejte spodaj). Porazdelitev kotov celične delitve v SAM ali IPR rastlin pCUC2 :: gai-1-VENUS se ni bistveno razlikovala od tiste pri divjem tipu, čeprav smo nepričakovano ugotovili, da so se celice brez IPR v teh rastlinah delile pri višji frekvenci 80–90 ° (sl. 6f–j).
Predlagano je bilo, da je smer celične delitve odvisna od geometrije SAM, zlasti od natezne napetosti, ki jo povzroča ukrivljenost tkiva46. Zato smo vprašali, ali je bila oblika SAM spremenjena v rastlinah della global mutant in pCUC2 :: gai-1-VENUS. Kot smo že poročali 12, je bila velikost mutantnega SAM della global večja od velikosti divjega tipa (dodatna slika 13a, b, d). In situ hibridizacija CLV3 in STM RNA je potrdila ekspanzijo meristema v della mutantih in nadalje pokazala lateralno ekspanzijo niše matičnih celic (dodatna slika 13e, f, h, i). Vendar pa je bila ukrivljenost SAM podobna pri obeh genotipih (dodatna slika 13k, m, n, p). Opazili smo podobno povečanje velikosti pri gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della štirikratnem mutantu brez spremembe ukrivljenosti v primerjavi z divjim tipom (dodatna slika 13c, d, g, j, l, o, p). Pogostost orientacije celične delitve je bila prizadeta tudi pri della štirikratnem mutantu, vendar v manjši meri kot pri della monolitnem mutantu (dopolnilna slika 12d-f). Ta učinek odmerjanja skupaj s pomanjkanjem učinka na ukrivljenost nakazuje, da preostala aktivnost RGL3 v štirikratnem mutantu Della omejuje spremembe v orientaciji celične delitve, ki jih povzroči izguba aktivnosti DELLA, in da se spremembe v stranskih delitvah celic pojavijo kot odgovor na spremembe v signalni aktivnosti GA in ne na spremembe v geometriji SAM. Kot je opisano zgoraj, promotor CUC2 poganja izražanje IPR v SAM, ki se začne pri P4 (dopolnilna slika 14a, b), in v nasprotju s tem je imel pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM zmanjšano velikost, vendar večjo ukrivljenost (dopolnilna slika 14c–h). Ta sprememba v morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM lahko povzroči drugačno porazdelitev mehanskih napetosti v primerjavi z divjim tipom, pri katerem se visoke obodne napetosti začnejo na krajši razdalji od centra SAM47. Druga možnost je, da so spremembe v morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM lahko posledica sprememb v regionalnih mehanskih lastnostih, ki jih povzroča ekspresija transgena48. V obeh primerih bi to lahko delno izravnalo učinke sprememb v signalizaciji GA s povečanjem verjetnosti, da se bodo celice delile v obodni/prečni orientaciji, kar pojasnjuje naša opažanja.
Naši podatki skupaj potrjujejo, da ima višja signalizacija GA aktivno vlogo pri stranski orientaciji ravnine celične delitve v IPR. Prav tako kažejo, da ukrivljenost meristema vpliva tudi na orientacijo ravnine celične delitve v IPR.
Prečna orientacija delitvene ravnine v IPR zaradi visoke signalne aktivnosti GA nakazuje, da GA vnaprej organizira radialno celično datoteko v povrhnjici znotraj SAM, da definira celično organizacijo, ki jo bomo kasneje našli v epidermalnem internodju. Dejansko so bile takšne celične datoteke pogosto vidne na slikah SAM mutantov della global (slika 6b). Tako smo za nadaljnje raziskovanje razvojne funkcije prostorskega vzorca signalizacije GA v SAM uporabili slikanje s časovnim zamikom za analizo prostorske organizacije celic v IPR v divjem tipu (Ler in Col-0), della globalnih mutantih in transgenih rastlinah pCUC2::gai-1-VENUS.
Ugotovili smo, da je qmRGA pokazala, da se je signalna aktivnost GA v IPR povečala od P1/P2 in dosegla vrh pri P4, ta vzorec pa je sčasoma ostal konstanten (sl. 4a–f in dopolnilna slika 8c–f, k). Za analizo prostorske organizacije celic v IPR z naraščajočim signalom GA smo celice Ler IPR označili zgoraj in ob straneh P4 glede na njihovo razvojno usodo, analizirano 34 ur po prvem opazovanju, tj. več kot dva plastidna časa, kar nam omogoča, da sledimo celicam IPR med razvojem primordija od P1/P2 do P4. Uporabili smo tri različne barve: rumeno za tiste celice, ki so bile integrirane v primordij blizu P4, zeleno za tiste, ki so bile v IPR, in vijolično za tiste, ki so sodelovale v obeh procesih (sl. 7a–c). Pri t0 (0 h) sta bili pred P4 vidni 1–2 plasti celic IPR (slika 7a). Kot je bilo pričakovano, ko so se te celice delile, so to storile predvsem preko prečne delitvene ravnine (sliki 7a–c). Podobni rezultati so bili pridobljeni z uporabo Col-0 SAM (s poudarkom na P3, katerega meja se zloži podobno kot P4 v Ler), čeprav je v tem genotipu guba, oblikovana na cvetni meji, hitreje skrila celice IPR (sl. 7g-i). Tako delitveni vzorec celic IPR vnaprej organizira celice v radialne vrste, kot v internodijih. Organizacija radialnih vrst in lokalizacija celic IPR med zaporednimi organi nakazujeta, da so te celice internodalni progenitorji.
Tukaj smo razvili razmernometrični signalni biosenzor GA, qmRGA, ki omogoča kvantitativno preslikavo signalne aktivnosti GA, ki izhaja iz kombiniranih koncentracij GA in receptorjev GA, hkrati pa zmanjša motnje endogenih signalnih poti, s čimer zagotavlja informacije o delovanju GA na celični ravni. V ta namen smo izdelali modificiran DELLA protein, mRGA, ki je izgubil sposobnost vezave DELLA interakcijskih partnerjev, vendar ostaja občutljiv na proteolizo, ki jo povzroča GA. qmRGA se odziva na eksogene in endogene spremembe ravni GA, njegove lastnosti dinamičnega zaznavanja pa omogočajo oceno prostorsko-časovnih sprememb v signalni aktivnosti GA med razvojem. qmRGA je tudi zelo prilagodljivo orodje, saj ga je mogoče prilagoditi različnim tkivom s spremembo promotorja, ki se uporablja za njegovo izražanje (če je potrebno), in glede na ohranjeno naravo signalne poti GA in motiva PFYRE v kritosemenkah je verjetno prenosljiv na druge vrste22. V skladu s tem se je tudi pokazalo, da enaka mutacija v riževem proteinu SLR1 DELLA (HYY497AAA) zavira aktivnost represorja rasti SLR1, medtem ko le rahlo zmanjša njegovo razgradnjo, ki jo posreduje GA, podobno kot mRGA23. Predvsem nedavne študije pri Arabidopsisu so pokazale, da je ena sama aminokislinska mutacija v domeni PFYRE (S474L) spremenila transkripcijsko aktivnost RGA, ne da bi vplivala na njegovo sposobnost interakcije s partnerji transkripcijskega faktorja50. Čeprav je ta mutacija zelo blizu 3 aminokislinskim substitucijam, ki so prisotne v mRGA, naše študije kažejo, da ti dve mutaciji spremenita različne značilnosti DELLA. Čeprav se večina partnerjev transkripcijskih faktorjev veže na domeni LHR1 in SAW DELLA26, 51, lahko nekatere ohranjene aminokisline v domeni PFYRE pomagajo stabilizirati te interakcije.
Razvoj internodijev je ključna lastnost v arhitekturi rastlin in izboljšanju donosa. qmRGA je razkril višjo signalno aktivnost GA v matičnih celicah internodija IPR. S kombinacijo kvantitativnega slikanja in genetike smo pokazali, da signalni vzorci GA prekrivajo ravnine krožne/prečne celične delitve v povrhnjici SAM, kar oblikuje organizacijo celične delitve, potrebno za razvoj internodijev. Med razvojem je bilo identificiranih več regulatorjev orientacije ravnine celične delitve 52, 53. Naše delo je jasen primer, kako aktivnost signalizacije GA uravnava ta celični parameter. DELLA lahko medsebojno deluje s predzloženimi proteinskimi kompleksi41, tako da lahko signalizacija GA uravnava orientacijo ravnine celične delitve z neposrednim vplivanjem na orientacijo kortikalnih mikrotubulov40,41,54,55. Nepričakovano smo pokazali, da pri SAM korelat višje signalne aktivnosti GA ni bil raztezek ali delitev celice, temveč le anizotropija rasti, kar je skladno z neposrednim učinkom GA na smer celične delitve v IPR. Vendar pa ne moremo izključiti, da bi bil ta učinek lahko tudi posreden, na primer posredovan z mehčanjem celične stene, ki ga povzroči GA56. Spremembe v lastnostih celične stene povzročijo mehanski stres 57, 58, ki lahko vpliva tudi na orientacijo ravnine celične delitve, tako da vpliva na orientacijo kortikalnih mikrotubulov 39, 46, 59. Kombinirani učinki mehanskega stresa, ki ga povzroča GA, in neposredne regulacije orientacije mikrotubulov s strani GA so lahko vključeni v generiranje specifičnega vzorca orientacije celične delitve v IPR za opredelitev internodijev, zato so potrebne nadaljnje študije za testiranje te ideje. Podobno so prejšnje študije poudarile pomen proteinov TCP14 in 15, ki medsebojno delujejo z DELLA, pri nadzoru tvorbe internodijev 60, 61 in ti dejavniki lahko posredujejo pri delovanju GA skupaj z BREVIPEDICELLUS (BP) in PENNYWISE (PNY), ki uravnavata razvoj internodijev in dokazano vplivata na signalizacijo GA 2, 62. Glede na to, da DELLA interagirajo s signalnimi potmi brasinosteroidov, etilena, jasmonske kisline in abscizinske kisline (ABA) 63, 64 in da lahko ti hormoni vplivajo na orientacijo mikrotubulov 65, lahko učinke GA na orientacijo celične delitve posredujejo tudi drugi hormoni.
Zgodnje citološke študije so pokazale, da sta za razvoj internodijev potrebna notranja in zunanja regija Arabidopsis SAM 2,42. Dejstvo, da GA aktivno uravnava delitev celic v notranjih tkivih12, podpira dvojno funkcijo GA pri uravnavanju velikosti meristema in internodija v SAM. Vzorec usmerjene celične delitve je tudi strogo reguliran v notranjem tkivu SAM in ta regulacija je bistvena za rast stebla52. Zanimivo bo preučiti, ali ima GA tudi vlogo pri usmerjanju ravnine celične delitve v notranji organizaciji SAM, s čimer sinhronizira specifikacijo in razvoj internodijev znotraj SAM.
Rastline so bile gojene in vitro v zemlji ali 1x Murashige-Skoog (MS) mediju (Duchefa), dopolnjenem z 1 % saharoze in 1 % agarja (Sigma) pri standardnih pogojih (16 h svetlobe, 22 °C), razen za poskuse rasti hipokotila in korenin, v katerih so sadike gojili na navpičnih ploščah pri stalni svetlobi in 22 °C. Za poskuse z nitrati so rastline gojili na modificiranem gojišču MS (rastlinski medij bioWORLD), dopolnjenem z ustreznim nitratom (0 ali 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinata, 1 % saharoze in 1 % A-agarja (Sigma) v pogojih dolgega dneva.
GID1a cDNA, vstavljena v pDONR221, je bila rekombinirana s pDONR P4-P1R-pUBQ10 in pDONR P2R-P3-mCherry v pB7m34GW, da se ustvari pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2, vstavljena v pDONR221, je bila rekombinirana v pB7RWG266, da se ustvari p35S:IDD2-RFP. Za generiranje pGID1b::2xmTQ2-GID1b sta bila 3,9 kb velik fragment navzgor od kodirne regije GID1b in 4,7 kb fragment, ki je vseboval cDNA GID1b (1,3 kb) in terminator (3,4 kb), najprej pomnožen s primerji v dodatni tabeli 3 in nato vstavljen v pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) oziroma pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) in končno rekombiniran s pDONR221 2xmTQ268 v ciljni vektor pGreen 012567 z uporabo Gateway kloniranja. Za generiranje pCUC2::LSSmOrange je bilo promotorsko zaporedje CUC2 (3229 bp pred ATG), ki mu je sledilo kodirno zaporedje velikega Stokesovega zamika mOrange (LSSmOrange)69 s signalom za jedrsko lokalizacijo N7 in transkripcijskim terminatorjem NOS, sestavljeno v ciljni vektor pGreen kanamicina z uporabo 3-fragmentnega rekombinacijskega sistema Gateway (Invitrogen). Rastlinski binarni vektor smo vnesli v sev GV3101 Agrobacterium tumefaciens in ga vnesli v liste Nicotiana benthamiana z metodo infiltracije z Agrobacterium in v Arabidopsis thaliana Col-0 z metodo cvetnega potopa. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry in pCLV3::mCherry-NLS qmRGA smo izolirali iz F3 oziroma F1 potomcev ustreznih križanj.
Hibridizacija RNA in situ je bila izvedena na približno 1 cm dolgih konicah poganjkov72, ki so bile zbrane in takoj fiksirane v raztopini FAA (3,7 % formaldehida, 5 % ocetne kisline, 50 % etanola), predhodno ohlajeni na 4 °C. Po 2 × 15 minutnih vakuumskih obdelavah je bil fiksativ zamenjan in vzorci inkubirani čez noč. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 in RGL3 ter antisense sonde za njihove 3′-UTR so bile sintetizirane z uporabo začetnih oligonukleotidov, prikazanih v dodatni tabeli 3, kot so opisali Rosier et al.73. Sonde, označene z digoksigeninom, so bile imunodetektirane z uporabo protiteles proti digoksigeninu (3000-kratna razredčitev; Roche, kataloška številka: 11 093 274 910), rezine pa so bile obarvane z raztopino 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfata (BCIP, 250-kratna razredčitev)/nitromodrega tetrazolija (NBT, 200-kratna razredčitev).
Čas objave: 10. februarja 2025