Rast apikalnega meristema (SAM) poganjka je ključnega pomena za arhitekturo stebla. Rastlinski hormonigiberelini(GA) igrajo ključno vlogo pri koordinaciji rasti rastlin, vendar njihova vloga v SAM ostaja slabo razumljena. Tukaj smo razvili ratiometrični biosenzor GA signalizacije z inženiringom proteina PELL, ki zavira njegovo bistveno regulatorno funkcijo v transkripcijskem odzivu GA, hkrati pa ohranja njegovo razgradnjo ob prepoznavanju GA. Dokazujemo, da ta biosenzor, ki temelji na razgradnji, natančno beleži spremembe v ravneh GA in celičnem zaznavanju med razvojem. Ta biosenzor smo uporabili za kartiranje aktivnosti GA signalizacije v SAM. Pokazali smo, da so visoki signali GA prisotni predvsem v celicah, ki se nahajajo med primordiji organov, ki so predhodniki celic internodija. Z uporabo pristopov pridobitve in izgube funkcije nadalje dokazujemo, da GA uravnava orientacijo ravnine delitve celic, s čimer vzpostavlja kanonično celično organizacijo internodijev in s tem spodbuja specifikacijo internodijev v SAM.
Apikalni meristem (SAM), ki se nahaja na vrhu poganjka, vsebuje nišo matičnih celic, katerih aktivnost modularno in iterativno ustvarja stranske organe in stebelna vozlišča skozi celotno življenjsko dobo rastline. Vsaka od teh ponavljajočih se enot ali rastlinskih vozlišč vključuje internodije in stranske organe na vozliščih ter aksilarne meristeme v pazduhah listov1. Rast in organizacija rastlinskih vozlišč se med razvojem spreminjata. Pri Arabidopsis je rast internodijev med vegetativno fazo zatrta, aksilarni meristemi pa ostanejo mirujoči v pazduhah listov rozete. Med prehodom v cvetno fazo SAM postane socvetni meristem, ki ustvarja podolgovate internodije in aksilarne popke, vejice v pazduhah stebelnih listov in kasneje brezlistne cvetove2. Čeprav smo dosegli pomemben napredek pri razumevanju mehanizmov, ki nadzorujejo nastanek listov, cvetov in vej, je o nastanku internodijev znanega relativno malo.
Razumevanje prostorsko-časovne porazdelitve GA bo pripomoglo k boljšemu razumevanju funkcij teh hormonov v različnih tkivih in v različnih razvojnih fazah. Vizualizacija razgradnje fuzije RGA-GFP, izražene pod delovanjem lastnega promotorja, zagotavlja pomembne informacije o regulaciji skupnih ravni GA v koreninah15,16. Vendar pa se izražanje RGA razlikuje med tkivi17 in ga regulira GA18. Tako lahko diferencialna ekspresija promotorja RGA povzroči fluorescenčni vzorec, ki ga opazimo pri RGA-GFP, zato ta metoda ni kvantitativna. Pred kratkim je bioaktivni fluorescein (Fl) označen GA19,20 razkril kopičenje GA v endokorteksu korenin in regulacijo njegovih celičnih ravni s transportom GA. Pred kratkim je senzor GA FRET nlsGPS1 pokazal, da so ravni GA povezane z raztezanjem celic v koreninah, filamentih in temno zraslih hipokotilih21. Vendar pa, kot smo videli, koncentracija GA ni edini parameter, ki nadzoruje aktivnost signalizacije GA, saj je odvisna od kompleksnih procesov zaznavanja. Tukaj, na podlagi našega razumevanja signalnih poti in GA, poročamo o razvoju in karakterizaciji na degradaciji temelječega ratiometričnega biosenzorja za signalizacijo GA. Za razvoj tega kvantitativnega biosenzorja smo uporabili mutantni RGA, občutljiv na GA, ki je bil spojen s fluorescentnim proteinom in se vseprisotno izraža v tkivih, ter fluorescenčni protein, neobčutljiv na GA. Pokazali smo, da fuzije mutantnih proteinov RGA ne motijo endogene signalizacije GA, ko so vseprisotno izražene, in da lahko ta biosenzor kvantificira signalno aktivnost, ki izhaja tako iz vhoda GA kot iz obdelave signala GA s strani senzorja z visoko prostorsko-časovno ločljivostjo. Ta biosenzor smo uporabili za kartiranje prostorsko-časovne porazdelitve signalne aktivnosti GA in kvantificiranje, kako GA uravnava celično vedenje v epidermisu SAM. Pokazali smo, da GA uravnava orientacijo delitvene ravnine celic SAM, ki se nahajajo med primordiji organov, in s tem definira kanonično celično organizacijo internodija.
Nazadnje smo se vprašali, ali lahko qmRGA poroča o spremembah v endogenih ravneh GA z uporabo rastočih hipokotilov. Predhodno smo pokazali, da nitrat spodbuja rast s povečanjem sinteze GA in posledično razgradnje PE34. V skladu s tem smo opazili, da je bila dolžina hipokotila v sadikih pUBQ10::qmRGA, vzgojenih v obilni oskrbi z nitrati (10 mM NO3−), bistveno daljša kot pri sadikih, vzgojenih v pogojih pomanjkanja nitratov (dodatna slika 6a). V skladu z odzivom rasti so bili signali GA višji v hipokotilih sadik, vzgojenih v pogojih 10 mM NO3−, kot v sadikih, vzgojenih brez nitrata (dodatna slika 6b, c). Tako qmRGA omogoča tudi spremljanje sprememb v signalizaciji GA, ki jih povzročajo endogene spremembe koncentracije GA.
Da bi razumeli, ali je signalna aktivnost GA, ki jo zazna qmRGA, odvisna od koncentracije GA in zaznavanja GA, kot je bilo pričakovano na podlagi zasnove senzorja, smo analizirali izražanje treh receptorjev GID1 v vegetativnih in reproduktivnih tkivih. Pri sadikah je reporterska linija GID1-GUS pokazala, da sta bila GID1a in c visoko izražena v kličnih listih (slika 3a–c). Poleg tega so bili vsi trije receptorji izraženi v listih, stranskih koreninskih začetkih, koreninskih vršičkih (razen koreninske kapice GID1b) in žilnem sistemu (slika 3a–c). V socvetju SAM smo zaznali signale GUS samo za GID1b in 1c (dodatna slika 7a–c). Hibridizacija in situ je potrdila te vzorce izražanja in nadalje pokazala, da je bil GID1c enakomerno izražen na nizkih ravneh v SAM, medtem ko je GID1b pokazal višjo ekspresijo na periferiji SAM (dodatna slika 7d–l). Translacijska fuzija pGID1b::2xmTQ2-GID1b je prav tako pokazala stopnjevano izražanje GID1b, od nizkega ali nobenega izražanja v središču SAM do visokega izražanja na mejah organov (dodatna slika 7m). Tako receptorji GID1 niso enakomerno porazdeljeni po tkivih in znotraj njih. V nadaljnjih poskusih smo tudi opazili, da je prekomerno izražanje GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) povečalo občutljivost qmRGA v hipokotilih na zunanjo aplikacijo GA (slika 3d, e). Nasprotno pa je bila fluorescenca, izmerjena s qd17mRGA v hipokotilu, neobčutljiva na obdelavo z GA3 (slika 3f, g). V obeh testih so bile sadike obdelane z visokimi koncentracijami GA (100 μM GA3), da bi ocenili hitro delovanje senzorja, kjer se je sposobnost vezave na receptor GID1 povečala ali izgubila. Ti rezultati skupaj potrjujejo, da biosenzor qmRGA služi kombinirani funkciji kot senzor GA in GA, in kažejo, da lahko diferencialna ekspresija receptorja GID1 znatno modulira emisivnost senzorja.
Do danes porazdelitev signalov GA v SAM ostaja nejasna. Zato smo uporabili rastline, ki izražajo qmRGA, in reporter matičnih celic pCLV3::mCherry-NLS35 za izračun visokoločljivostnih kvantitativnih zemljevidov signalne aktivnosti GA, s poudarkom na plasti L1 (epidermis; slika 4a, b, glej Metode in dodatne metode), saj ima L1 ključno vlogo pri nadzoru rasti SAM36. Tukaj je izražanje pCLV3::mCherry-NLS zagotovilo fiksno geometrijsko referenčno točko za analizo prostorsko-časovne porazdelitve signalne aktivnosti GA37. Čeprav GA velja za bistveno za razvoj stranskih organov4, smo opazili, da so bili signali GA nizki v cvetnem primordiju (P), začenši s stopnjo P3 (slika 4a, b), medtem ko so imeli mladi primordiji P1 in P2 zmerno aktivnost, podobno tisti v osrednjem območju (slika 4a, b). Na mejah primordija organov je bila zaznana višja signalna aktivnost GA, začenši pri P1/P2 (ob straneh meje) in dosegajoč vrh pri P4, kot tudi v vseh celicah periferne regije, ki se nahaja med primordiji (slika 4a, b in dopolnilna slika 8a, b). Ta višja signalna aktivnost GA je bila opažena ne le v epidermisu, temveč tudi v plasteh L2 in zgornjih L3 (dodatna slika 8b). Vzorec signalov GA, zaznanih v SAM z uporabo qmRGA, je sčasoma ostal nespremenjen (dodatna slika 8c–f, k). Čeprav je bil konstrukt qd17mRGA sistematično znižan v SAM rastlin T3 iz petih neodvisnih linij, ki smo jih podrobno okarakterizirali, smo lahko analizirali fluorescenčne vzorce, pridobljene s konstruktom pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (dodatna slika 8g–j, l). V tej kontrolni liniji so bile v SAM zaznane le manjše spremembe v razmerju fluorescence, v središču SAM pa smo opazili jasno in nepričakovano zmanjšanje VENUS, povezanega s TagBFP. To potrjuje, da signalni vzorec, ki ga opazuje qmRGA, odraža od GA odvisno razgradnjo mRGA-VENUS, hkrati pa kaže, da lahko qmRGA precenjuje signalno aktivnost GA v središču meristema. Skratka, naši rezultati razkrivajo signalni vzorec GA, ki v prvi vrsti odraža porazdelitev primordijev. Ta porazdelitev medprimordialne regije (IPR) je posledica postopnega vzpostavljanja visoke signalne aktivnosti GA med razvijajočim se primordijem in osrednjo regijo, medtem ko se hkrati signalna aktivnost GA v primordiju zmanjšuje (slika 4c, d).
Porazdelitev receptorjev GID1b in GID1c (glej zgoraj) kaže, da diferencialna ekspresija receptorjev GA pomaga oblikovati vzorec aktivnosti signalizacije GA v SAM. Spraševali smo se, ali bi lahko prišlo do diferencialnega kopičenja GA. Za raziskavo te možnosti smo uporabili senzor nlsGPS1 GA FRET21. V SAM nlsGPS1, obdelanega z 10 μM GA4+7 100 minut, smo zaznali povečano frekvenco aktivacije (dodatna slika 9a–e), kar kaže, da se nlsGPS1 odziva na spremembe koncentracije GA v SAM, tako kot v koreninah21. Prostorska porazdelitev frekvence aktivacije nlsGPS1 je pokazala relativno nizke ravni GA v zunanjih plasteh SAM, vendar je pokazala, da so povišane v središču in na robovih SAM (slika 4e in dodatna slika 9a,c). To kaže, da je GA tudi v SAM porazdeljena s prostorskim vzorcem, primerljivim s tistim, ki ga je pokazal qmRGA. Kot dopolnilni pristop smo SAM obdelali tudi s fluorescentnim GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ali samo s Fl kot negativno kontrolo. Signal Fl je bil porazdeljen po celotnem SAM, vključno z osrednjim območjem in primordijem, čeprav z nižjo intenzivnostjo (slika 4j in dopolnilna slika 10d). Nasprotno pa so se vsi trije GA-Fl kopičili specifično znotraj meja primordija in v različni meri v preostalem IPR, pri čemer se je GA7-Fl kopičil v največji domeni v IPR (slika 4k in dopolnilna slika 10a,b). Kvantifikacija intenzivnosti fluorescence je pokazala, da je bilo razmerje med intenzivnostjo IPR in ne-IPR višje v SAM, obdelanem z GA-Fl, v primerjavi s SAM, obdelanim s Fl (slika 4l in dopolnilna slika 10c). Ti rezultati skupaj kažejo, da je GA prisoten v višjih koncentracijah v celicah IPR, ki se nahajajo najbližje meji organa. To kaže, da vzorec signalne aktivnosti SAM GA izhaja tako iz diferencialne ekspresije receptorjev GA kot iz diferencialne akumulacije GA v celicah IPR blizu meja organov. Naša analiza je tako razkrila nepričakovan prostorsko-časovni vzorec signalizacije GA, z nižjo aktivnostjo v središču in primordiju SAM ter višjo aktivnostjo v IPR v periferni regiji.
Da bi razumeli vlogo diferencialne signalne aktivnosti GA v SAM, smo analizirali korelacijo med signalno aktivnostjo GA, celično ekspanzijo in delitvijo celic z uporabo slikanja v realnem času s časovnim zamikom SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Glede na vlogo GA pri regulaciji rasti je bila pričakovana pozitivna korelacija s parametri celične ekspanzije. Zato smo najprej primerjali zemljevide signalne aktivnosti GA z zemljevidi hitrosti rasti celične površine (kot približek za moč celične ekspanzije za dano celico in za hčerinske celice pri delitvi) in z zemljevidi rastne anizotropije, ki meri usmerjenost celične ekspanzije (uporabljena tudi tukaj za dano celico in za hčerinske celice pri delitvi; slika 5a,b, glej Metode in dodatne metode). Naši zemljevidi hitrosti rasti celične površine SAM so skladni s prejšnjimi opažanji38,39, z minimalnimi stopnjami rasti na meji in maksimalnimi stopnjami rasti v razvijajočih se cvetovih (slika 5a). Analiza glavnih komponent (PCA) je pokazala, da je bila signalna aktivnost GA negativno povezana z intenzivnostjo rasti celične površine (slika 5c). Pokazali smo tudi, da so glavne osi variacije, vključno z vhodno GA signalizacijo in intenzivnostjo rasti, pravokotne na smer, ki jo določa visoka ekspresija CLV3, kar potrjuje izključitev celic iz centra SAM v preostalih analizah. Spearmanova korelacijska analiza je potrdila rezultate PCA (slika 5d), kar kaže, da višji GA signali v IPR niso povzročili večje ekspanzije celic. Vendar pa je korelacijska analiza pokazala rahlo pozitivno korelacijo med aktivnostjo GA signalizacije in anizotropijo rasti (slika 5c, d), kar kaže, da višja GA signalizacija v IPR vpliva na smer rasti celic in morda na položaj ravnine delitve celic.
a, b Toplotni zemljevidi povprečne površinske rasti (a) in anizotropije rasti (b) v SAM, povprečeni za sedem neodvisnih rastlin (uporabljenih kot približki za moč in smer celične ekspanzije). c PCA analiza je vključevala naslednje spremenljivke: signal GA, intenzivnost površinske rasti, anizotropija površinske rasti in izražanje CLV3. Komponenta PCA 1 je bila večinoma negativno korelirana z intenzivnostjo površinske rasti in pozitivno korelirana s signalom GA. Komponenta PCA 2 je bila večinoma pozitivno korelirana z anizotropijo površinske rasti in negativno korelirana z izražanjem CLV3. Odstotki predstavljajo variacijo, ki jo pojasnjuje vsaka komponenta. d Spearmanova korelacijska analiza med signalom GA, intenzivnostjo površinske rasti in anizotropijo površinske rasti na tkivni lestvici brez CZ. Številka na desni je Spearmanova vrednost rho med dvema spremenljivkama. Zvezdice označujejo primere, kjer je korelacija/negativna korelacija zelo pomembna. e 3D vizualizacija celic Col-0 SAM L1 s konfokalno mikroskopijo. Nove celične stene, ki so nastale v SAM (vendar ne v primordiju) pri 10 urah, so obarvane glede na njihove kotne vrednosti. Barvna vrstica je prikazana v spodnjem desnem kotu. Vložek prikazuje ustrezno 3D-sliko pri 0 h. Poskus je bil dvakrat ponovljen s podobnimi rezultati. f Škatlasti diagrami prikazujejo stopnje delitve celic v IPR in ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 neodvisnih rastlin). Središčna črta prikazuje mediano, meje škatel pa označujejo 25. in 75. percentil. Brki označujejo najmanjše in največje vrednosti, določene s programsko opremo R. Vrednosti P so bile pridobljene z Welchovim dvostranskim t-testom. g, h Shematski diagram, ki prikazuje (g), kako izmeriti kot nove celične stene (magenta) glede na radialno smer od središča SAM (bela pikčasta črta) (upoštevajo se samo vrednosti ostrega kota, tj. 0–90°), in (h) obodne/stranske in radialne smeri znotraj meristema. i Frekvenčni histogrami orientacije ravnine delitve celic čez SAM (temno modra), IPR (srednje modra) in ne-IPR (svetlo modra). Vrednosti P so bile pridobljene z dvostranskim Kolmogorov-Smirnovim testom. Poskus je bil dvakrat ponovljen s podobnimi rezultati. j Frekvenčni histogrami orientacije ravnine delitve celic IPR okoli P3 (svetlo zelena), P4 (srednje zelena) in P5 (temno zelena). Vrednosti P so bile pridobljene z dvostranskim Kolmogorov-Smirnovim testom. Poskus je bil dvakrat ponovljen s podobnimi rezultati.
Zato smo nato raziskali korelacijo med signalizacijo GA in aktivnostjo celične delitve z identifikacijo novo nastalih celičnih sten med testom (slika 5e). Ta pristop nam je omogočil merjenje pogostosti in smeri celične delitve. Presenetljivo smo ugotovili, da je bila pogostost celičnih delitev v IPR in preostalem delu SAM (brez IPR, slika 5f) podobna, kar kaže, da razlike v signalizaciji GA med celicami IPR in ne-IPR ne vplivajo bistveno na delitev celic. To in pozitivna korelacija med signalizacijo GA in anizotropijo rasti sta nas spodbudila k razmisleku, ali bi lahko aktivnost signalizacije GA vplivala na orientacijo ravnine celične delitve. Izmerili smo orientacijo nove celične stene kot oster kot glede na radialno os, ki povezuje središče meristema in središče nove celične stene (slika 5e-i) in opazili jasno tendenco, da se celice delijo pod koti blizu 90° glede na radialno os, z najvišjimi frekvencami, opaženimi pri 70–80° (23,28 %) in 80–90° (22,62 %) (slika 5e,i), kar ustreza delitvi celic v obodni/prečni smeri (slika 5h). Da bi preučili prispevek signalizacije GA k temu vedenju delitve celic, smo ločeno analizirali parametre delitve celic v IPR in ne-IPR (slika 5i). Opazili smo, da se porazdelitev kotov delitve v celicah IPR razlikuje od porazdelitve v celicah brez IPR ali v celicah celotnega SAM, pri čemer so celice IPR pokazale večji delež lateralnih/krožnih celičnih delitev, tj. 70–80° in 80–90° (33,86 % oziroma 30,71 %, ustrezna razmerja) (slika 5i). Naša opazovanja so tako pokazala povezavo med visoko signalizacijo GA in orientacijo ravnine delitve celic blizu obodne smeri, podobno korelaciji med aktivnostjo signalizacije GA in anizotropijo rasti (slika 5c, d). Za nadaljnjo ugotovitev prostorske ohranitve te povezave smo izmerili orientacijo ravnine delitve v celicah IPR, ki obdajajo primordij, začenši od P3, saj je bila v tej regiji zaznana najvišja aktivnost signalizacije GA, začenši od P4 (slika 4). Koti delitve IPR okoli P3 in P4 niso pokazali statistično značilnih razlik, čeprav je bila v IPR okoli P4 opažena povečana pogostost lateralnih celičnih delitev (slika 5j). Vendar pa je v celicah IPR okoli P5 razlika v orientaciji ravnine celične delitve postala statistično pomembna, z močnim povečanjem pogostosti prečnih celičnih delitev (slika 5j). Ti rezultati skupaj kažejo, da lahko signalizacija GA nadzoruje orientacijo celičnih delitev v SAM, kar je skladno s prejšnjimi poročili40,41, da lahko visoka signalizacija GA povzroči lateralno orientacijo celičnih delitev v IPR.
Predvideva se, da celice v IPR ne bodo vključene v primordije, temveč v internodije2,42,43. Prečna orientacija celičnih delitev v IPR lahko povzroči tipično organizacijo vzporednih vzdolžnih vrst epidermalnih celic v internodijih. Naša zgoraj opisana opažanja kažejo, da signalizacija GA verjetno igra vlogo v tem procesu z uravnavanjem smeri delitve celic.
Izguba funkcije več genov DELA povzroči konstitutivni odziv GA, za testiranje te hipoteze pa se lahko uporabijo mutanti della44. Najprej smo analizirali vzorce izražanja petih genov DELA v SAM. Transkripcijska fuzija linije GUS45 je pokazala, da so bili GAI, RGA, RGL1 in RGL2 (v veliko manjši meri) izraženi v SAM (dodatna slika 11a–d). Hibridizacija in situ je nadalje pokazala, da se mRNA GAI kopiči posebej v primordijih in cvetovih v razvoju (dodatna slika 11e). mRNA RGL1 in RGL3 sta bili zaznani po celotni krošnji SAM in v starejših cvetovih, medtem ko je bila mRNA RGL2 bolj obilna v obrobnem območju (dodatna slika 11f–h). Konfokalno slikanje pRGL3::RGL3-GFP SAM je potrdilo izražanje, opaženo s hibridizacijo in situ, in pokazalo, da se protein RGL3 kopiči v osrednjem delu SAM (dodatna slika 11i). Z uporabo linije pRGA::GFP-RGA smo ugotovili tudi, da se protein RGA kopiči v SAM, vendar se njegova številčnost zmanjšuje na meji, začenši od P4 (dodatna slika 11j). Omeniti velja, da so vzorci izražanja RGL3 in RGA skladni z višjo signalno aktivnostjo GA v IPR, kot je bilo zaznano s qmRGA (slika 4). Poleg tega ti podatki kažejo, da so vsi DNA proteini izraženi v SAM in da njihova ekspresija skupaj zajema celoten SAM.
Nato smo analizirali parametre celične delitve pri divjem tipu SAM (Ler, kontrola) in mutantih gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (slika 6a, b). Zanimivo je, da smo opazili statistično pomemben premik v porazdelitvi frekvenc kotov celične delitve pri mutantu della global SAM v primerjavi z divjim tipom (slika 6c). Ta sprememba pri mutantu della global je bila posledica povečanja frekvence kotov 80–90° (34,71 % v primerjavi z 24,55 %) in v manjši meri kotov 70–80° (23,78 % v primerjavi z 20,18 %), kar ustreza prečnim celičnim delitvam (slika 6c). Pogostost neprečnih delitev (0–60°) je bila pri mutantu della global prav tako nižja (slika 6c). Pogostost prečnih celičnih delitev se je pri SAM mutanta della global znatno povečala (slika 6b). Pogostost transverzalnih celičnih delitev v IPR je bila prav tako višja pri mutantu della global v primerjavi z divjim tipom (slika 6d). Zunaj območja IPR je imel divji tip bolj enakomerno porazdelitev kotov celičnih delitev, medtem ko je mutant della global imel raje tangencialne delitve, kot je IPR (slika 6e). Kvantificirali smo tudi orientacijo celičnih delitev v SAM petkratnih mutantov ga2 oksidaze (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 in ga2ox6-2), kar je ozadje mutantov, neaktivnih za GA, v katerem se GA kopiči. V skladu s povečanjem ravni GA je bil SAM petkratnega mutanta ga2ox socvetja večji kot pri Col-0 (dodatna slika 12a, b), v primerjavi s Col-0 pa je petkratni ga2ox SAM pokazal izrazito drugačno porazdelitev kotov delitve celic, pri čemer se je frekvenca kotov povečala od 50° do 90°, kar je spet v prid tangencialnim delitvam (dodatna slika 12a–c). Tako smo pokazali, da konstitutivna aktivacija signalizacije GA in kopičenje GA povzročata lateralne delitve celic v IPR in preostalem delu SAM.
a, b 3D vizualizacija plasti L1 s PI obarvanega SAM Ler (a) in globalnega mutanta della (b) z uporabo konfokalne mikroskopije. Prikazane so nove celične stene, ki so nastale v SAM (vendar ne v primordiju) v 10-urnem obdobju, in so obarvane glede na njihove vrednosti kotov. Vstavek prikazuje SAM pri 0 h. Barvna vrstica je prikazana v spodnjem desnem kotu. Puščica v (b) kaže na primer poravnanih celičnih datotek v globalnem mutantu della. Poskus je bil dvakrat ponovljen s podobnimi rezultati. ce primerjava frekvenčne porazdelitve orientacij ravnin delitve celic v celotnem SAM (d), IPR (e) in ne-IPR (f) med Ler in globalno della. Vrednosti P so bile pridobljene z dvostranskim Kolmogorov-Smirnovim testom. f, g 3D vizualizacija konfokalnih slik s PI obarvanega SAM transgenih rastlin Col-0 (i) in pCUC2::gai-1-VENUS (j). Plošči (a, b) prikazujeta nove celične stene (vendar ne primordijev), ki so nastale v SAM v 10 urah. Poskus je bil dvakrat ponovljen s podobnimi rezultati. h–j Primerjava frekvenčne porazdelitve orientacij ravnin delitve celic, ki se nahajajo v celotnem SAM (h), IPR (i) in ne-IPR (j) med rastlinami Col-0 in pCUC2::gai-1-VENUS. Vrednosti P so bile pridobljene z dvostranskim Kolmogorov-Smirnovim testom.
Nato smo testirali učinek zaviranja signalizacije GA specifično v IPR. V ta namen smo uporabili promotor cotyledon cup 2 (CUC2) za spodbujanje izražanja dominantnega negativnega proteina gai-1, spojenega z VENUS (v liniji pCUC2::gai-1-VENUS). V divjem tipu SAM promotor CUC2 poganja izražanje večine IPR v SAM, vključno z mejnimi celicami, od P4 naprej, podobno specifično izražanje pa smo opazili tudi v rastlinah pCUC2::gai-1-VENUS (glej spodaj). Porazdelitev kotov delitve celic po SAM ali IPR rastlin pCUC2::gai-1-VENUS se ni bistveno razlikovala od porazdelitve divjega tipa, čeprav smo nepričakovano ugotovili, da se celice brez IPR v teh rastlinah delijo z višjo frekvenco 80–90° (slika 6f–j).
Predlagano je bilo, da je smer delitve celic odvisna od geometrije SAM, zlasti od natezne napetosti, ki jo povzroča ukrivljenost tkiva46. Zato smo se vprašali, ali se je oblika SAM spremenila pri mutantu della global in rastlinah pCUC2::gai-1-VENUS. Kot je bilo že poročano12, je bila velikost mutanta della global SAM večja kot pri divjem tipu (dodatna slika 13a, b, d). In situ hibridizacija CLV3 in STM RNA je potrdila širitev meristema pri mutantih della in nadalje pokazala lateralno širitev niše matičnih celic (dodatna slika 13e, f, h, i). Vendar pa je bila ukrivljenost SAM pri obeh genotipih podobna (dodatna slika 13k, m, n, p). Podobno povečanje velikosti smo opazili pri štirikratnem mutantu gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della brez spremembe ukrivljenosti v primerjavi z divjim tipom (dodatna slika 13c, d, g, j, l, o, p). Pogostost orientacije celičnih delitev je bila prav tako prizadeta pri štirikratnem mutantu della, vendar v manjši meri kot pri monolitnem mutantu della (dodatna slika 12d–f). Ta učinek odmerka, skupaj z odsotnostjo učinka na ukrivljenost, kaže, da preostala aktivnost RGL3 pri štirikratnem mutantu Della omejuje spremembe v orientaciji celičnih delitev, ki jih povzroča izguba aktivnosti DNA, in da se spremembe v lateralnih celičnih delitev pojavijo kot odziv na spremembe v signalni aktivnosti GA in ne na spremembe v geometriji SAM. Kot je opisano zgoraj, promotor CUC2 poganja izražanje IPR v SAM, začenši pri P4 (dodatna slika 14a, b), nasprotno pa je imel pCUC2::gai-1-VENUS SAM manjšo velikost, vendar večjo ukrivljenost (dodatna slika 14c–h). Ta sprememba morfologije pCUC2::gai-1-VENUS SAM lahko povzroči drugačno porazdelitev mehanskih napetosti v primerjavi z divjim tipom, pri katerem se visoke obodne napetosti začnejo na krajši razdalji od središča SAM47. Druga možnost je, da so spremembe morfologije pCUC2::gai-1-VENUS SAM posledica sprememb regionalnih mehanskih lastnosti, ki jih povzroča izražanje transgena48. V obeh primerih bi to lahko delno izravnalo učinke sprememb v signalizaciji GA s povečanjem verjetnosti, da se bodo celice delile v obodni/prečni orientaciji, kar pojasnjuje naša opažanja.
Naši podatki skupaj potrjujejo, da ima višja GA signalizacija aktivno vlogo pri lateralni orientaciji ravnine delitve celic v IPR. Prav tako kažejo, da ukrivljenost meristema vpliva tudi na orientacijo ravnine delitve celic v IPR.
Prečna orientacija delitvene ravnine v IPR zaradi visoke aktivnosti signalizacije GA kaže na to, da GA predhodno organizira radialno celično datoteko v epidermisu znotraj SAM, da definira celično organizacijo, ki jo bomo kasneje našli v epidermalnem internodiju. Dejansko so bile takšne celične datoteke pogosto vidne na slikah SAM mutantov della global (slika 6b). Da bi torej dodatno raziskali razvojno funkcijo prostorskega vzorca signalizacije GA v SAM, smo s slikanjem s časovnim zamikom analizirali prostorsko organizacijo celic v IPR pri transgenih rastlinah divjega tipa (Ler in Col-0), mutantih della global in pCUC2::gai-1-VENUS.
Ugotovili smo, da qmRGA kaže, da se aktivnost GA signalizacije v IPR povečuje od P1/P2 in dosega vrh pri P4, ta vzorec pa ostaja nespremenjen skozi čas (slika 4a–f in dopolnilna slika 8c–f, k). Za analizo prostorske organizacije celic v IPR z naraščajočim signalom GA smo označili celice Ler IPR nad in ob straneh P4 glede na njihovo razvojno usodo, analizirano 34 ur po prvem opazovanju, tj. več kot dva časa plastide, kar nam je omogočilo sledenje celicam IPR med razvojem primordija od P1/P2 do P4. Uporabili smo tri različne barve: rumeno za tiste celice, ki so bile integrirane v primordij blizu P4, zeleno za tiste, ki so bile v IPR, in vijolično za tiste, ki so sodelovale v obeh procesih (slika 7a–c). Pri t0 (0 h) so bile pred P4 vidne 1–2 plasti celic IPR (slika 7a). Kot je bilo pričakovati, so se te celice pri delitvi delile predvsem preko prečne delitvene ravnine (sliki 7a–c). Podobni rezultati so bili pridobljeni z uporabo Col-0 SAM (s poudarkom na P3, katerega rob se guba podobno kot P4 pri Ler), čeprav je pri tem genotipu guba, ki je nastala na cvetnem robu, hitreje skrila celice IPR (slika 7g–i). Tako vzorec delitve celic IPR predhodno organizira celice v radialne vrste, kot v internodijih. Organizacija radialnih vrst in lokalizacija celic IPR med zaporednimi organi kažeta, da so te celice internodalne progenitorke.
Tukaj smo razvili ratiometrični biosenzor za signalizacijo GA, qmRGA, ki omogoča kvantitativno kartiranje signalne aktivnosti GA, ki izhaja iz kombiniranih koncentracij GA in receptorjev GA, hkrati pa zmanjšuje motnje v endogenih signalnih poteh, s čimer zagotavlja informacije o delovanju GA na celični ravni. V ta namen smo konstruirali modificiran protein PELL, mRGA, ki je izgubil sposobnost vezave na partnerje interakcije PELL, vendar ostaja občutljiv na proteolizo, ki jo povzroča GA. qmRGA se odziva tako na eksogene kot endogene spremembe v ravneh GA, njegove dinamične senzorične lastnosti pa omogočajo oceno prostorsko-časovnih sprememb v signalni aktivnosti GA med razvojem. qmRGA je tudi zelo prilagodljivo orodje, saj ga je mogoče prilagoditi različnim tkivom s spremembo promotorja, ki se uporablja za njegovo izražanje (če je potrebno), in glede na ohranjeno naravo signalne poti GA in motiva PFYRE pri kritosemenkah je verjetno prenosljiv na druge vrste22. V skladu s tem je bilo dokazano, da enakovredna mutacija v riževem proteinu SLR1DELLA (HYY497AAA) zavira aktivnost represorja rasti SLR1, hkrati pa le nekoliko zmanjšuje njegovo razgradnjo, ki jo posreduje GA, podobno kot pri mRGA23. Omeniti velja, da so nedavne študije pri Arabidopsis pokazale, da je ena sama mutacija aminokisline v domeni PFYRE (S474L) spremenila transkripcijsko aktivnost RGA, ne da bi vplivala na njeno sposobnost interakcije s partnerskimi transkripcijskimi faktorji50. Čeprav je ta mutacija zelo blizu 3 substitucijam aminokislin, prisotnim v mRGA, naše študije kažejo, da ti dve mutaciji spreminjata različne značilnosti Čeprav se večina partnerskih transkripcijskih faktorjev veže na domeni LHR1 in SAW26,51, lahko nekatere ohranjene aminokisline v domeni PFYRE pomagajo stabilizirati te interakcije.
Razvoj internodijev je ključna lastnost rastlinske arhitekture in izboljšanja pridelka. qmRGA je pokazala višjo aktivnost signalizacije GA v internodijskih progenitornih celicah IPR. Z združevanjem kvantitativnega slikanja in genetike smo pokazali, da vzorci signalizacije GA prekrivajo krožne/prečne ravnine delitve celic v epidermisu SAM, kar oblikuje organizacijo delitve celic, potrebno za razvoj internodijev. Med razvojem je bilo identificiranih več regulatorjev orientacije ravnine delitve celic52,53. Naše delo ponuja jasen primer, kako aktivnost signalizacije GA uravnava ta celični parameter. lahko interagira s kompleksi beljakovin pred zvijanjem41, zato lahko signalizacija GA uravnava orientacijo ravnine delitve celic tako, da neposredno vpliva na orientacijo kortikalnih mikrotubulov40,41,54,55. Nepričakovano smo pokazali, da v SAM korelat višje aktivnosti signalizacije GA ni bila podaljševanje ali delitev celic, temveč le anizotropija rasti, kar je skladno z neposrednim učinkom GA na smer delitve celic v IPR. Vendar ne moremo izključiti, da bi bil ta učinek lahko tudi posreden, na primer posredovan z mehčanjem celične stene, ki ga povzroča GA56. Spremembe lastnosti celične stene povzročajo mehanski stres57,58, ki lahko vpliva tudi na orientacijo ravnine delitve celic, tako da vpliva na orientacijo kortikalnih mikrotubulov39,46,59. Kombinirani učinki mehanskega stresa, ki ga povzroča GA, in neposredne regulacije orientacije mikrotubulov z GA so lahko vključeni v ustvarjanje specifičnega vzorca orientacije delitve celic v IPR za definiranje internodijev, zato so potrebne nadaljnje študije za preizkus te ideje. Podobno so prejšnje študije poudarile pomen proteinov TCP14 in 15, ki interagirajo z DNA, pri nadzoru nastajanja internodijev60,61, in ti dejavniki lahko posredujejo pri delovanju GA skupaj z BREVIPEDICELLUS (BP) in PENNYWISE (PNY), ki uravnavata razvoj internodijev in za katere je bilo dokazano, da vplivajo na signalizacijo GA2,62. Glede na to, da DNA-ji interagirajo s signalnimi potmi brasinosteroidov, etilena, jasmonske kisline in abscisinske kisline (ABA)63,64 in da lahko ti hormoni vplivajo na orientacijo mikrotubulov65, lahko učinke GA na orientacijo celične delitve posredujejo tudi drugi hormoni.
Zgodnje citološke študije so pokazale, da sta za razvoj internodija potrebna tako notranja kot zunanja regija Arabidopsis SAM2,42. Dejstvo, da GA aktivno uravnava delitev celic v notranjih tkivih12, podpira dvojno funkcijo GA pri uravnavanju meristema in velikosti internodija v SAM. Vzorec usmerjene delitve celic je strogo reguliran tudi v notranjem tkivu SAM in ta regulacija je bistvena za rast stebla52. Zanimivo bo preučiti, ali GA igra tudi vlogo pri usmerjanju ravnine delitve celic v notranji organizaciji SAM, s čimer sinhronizira specifikacijo in razvoj internodija znotraj SAM.
Rastline so gojili in vitro v zemlji ali gojišču 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa), dopolnjenem z 1 % saharoze in 1 % agarja (Sigma), v standardnih pogojih (16 ur svetlobe, 22 °C), razen za poskuse rasti hipokotila in korenin, pri katerih so sadike gojili na navpičnih ploščah pri konstantni svetlobi in 22 °C. Za poskuse z nitrati so rastline gojili na modificiranem gojišču MS (rastlinski medij bioWORLD), dopolnjenem z ustrezno količino nitrata (0 ali 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinata, 1 % saharoze in 1 % A-agarja (Sigma) v pogojih dolgega dne.
cDNA GID1a, vstavljena v pDONR221, je bila rekombinirana s pDONR P4-P1R-pUBQ10 in pDONR P2R-P3-mCherry v pB7m34GW, da je nastal pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2, vstavljena v pDONR221, je bila rekombinirana v pB7RWG266, da je nastal p35S:IDD2-RFP. Za tvorbo pGID1b::2xmTQ2-GID1b smo najprej z uporabo primerjev v dodatni tabeli 3 pomnožili 3,9 kb fragment pred kodirajočo regijo GID1b in 4,7 kb fragment, ki je vseboval cDNA GID1b (1,3 kb) in terminator (3,4 kb), nato pa ju vstavili v pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) oziroma pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) in na koncu rekombinirali s pDONR221 2xmTQ268 v ciljni vektor pGreen 012567 z uporabo kloniranja Gateway. Za tvorbo pCUC2::LSSmOrange smo v vektor za ciljanje kanamicina pGreen z uporabo sistema rekombinacije 3-fragmentov Gateway (Invitrogen) sestavili promotorsko zaporedje CUC2 (3229 bp pred ATG), ki mu je sledilo kodirajoče zaporedje velikega Stokes-premaknjenega mOrange (LSSmOrange)69 z jedrnim lokalizacijskim signalom N7 in transkripcijskim terminatorjem NOS. Rastlinski binarni vektor smo vnesli v sev Agrobacterium tumefaciens GV3101 in v liste Nicotiana benthamiana z metodo infiltracije Agrobacterium ter v Arabidopsis thaliana Col-0 z metodo cvetnega potapljanja. pUBQ10::qmRGA Iz potomcev F3 in F1 ustreznih križanj smo izolirali pUBQ10::GID1a-mCherry in pCLV3::mCherry-NLS qmRGA.
Hibridizacija RNA in situ je bila izvedena na približno 1 cm dolgih konicah poganjkov72, ki so bile zbrane in takoj fiksirane v raztopini FAA (3,7 % formaldehida, 5 % ocetne kisline, 50 % etanola), predhodno ohlajeni na 4 °C. Po 2 × 15 minutnih vakuumskih obdelavah je bil fiksativ zamenjan in vzorci inkubirani čez noč. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 in RGL3 ter antisense sonde za njihove 3′-UTR so bile sintetizirane z uporabo začetnih oligonukleotidov, prikazanih v dodatni tabeli 3, kot so opisali Rosier et al.73. Sonde, označene z digoksigeninom, so bile imunodetektirane z uporabo protiteles proti digoksigeninu (3000-kratna razredčitev; Roche, kataloška številka: 11 093 274 910), rezine pa so bile obarvane z raztopino 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfata (BCIP, 250-kratna razredčitev)/nitromodrega tetrazolija (NBT, 200-kratna razredčitev).
Čas objave: 10. februar 2025