DELLA proteini so ohranjeniregulatorji rastiki igrajo osrednjo vlogo pri razvoju rastlin kot odgovor na notranje in zunanje signale. Kot regulatorji transkripcije se DELLA vežejo na transkripcijske faktorje (TF) in histon H2A prek svojih domen GRAS in se rekrutirajo za delovanje na promotorje. Nedavne študije so pokazale, da je stabilnost DELLA regulirana posttranslacijsko z dvema mehanizmoma: poliubikvitinacijo, ki jo povzroči rastlinski hormongiberelin, kar vodi do njihove hitre razgradnje in konjugacije z majhnim ubikvitinu podobnim modifikatorjem (SUMO), kar poveča njihovo kopičenje. Poleg tega je aktivnost DELLA dinamično regulirana z dvema različnima mehanizmoma glikozilacije: O-fukozilacija poveča interakcijo DELLA-TF, medtem ko O-povezana modifikacija N-acetilglukozamina (O-GlcNAc) zavira interakcijo DELLA-TF. Vendar pa vloga fosforilacije DELLA ni jasna, saj so prejšnje študije pokazale nasprotujoče si rezultate, pri čemer nekatere kažejo, da fosforilacija spodbuja ali zavira razgradnjo DELLA, druge pa, da fosforilacija ne vpliva na njihovo stabilnost. Tukaj identificiramo mesta fosforilacije v represorju GA1-3 (RGA), AtDELLA, očiščenem iz Arabidopsis thaliana z masno spektrometrijo in pokažemo, da fosforilacija dveh peptidov RGA v regijah PolyS in PolyS/T poveča aktivnost RGA s spodbujanjem vezave H2A in povezave RGA s ciljnimi promotorji. Predvsem fosforilacija ni vplivala na interakcije RGA-TF ali stabilnost RGA. Naša študija razkriva molekularni mehanizem, s katerim fosforilacija inducira aktivnost DELLA.
Naša masna spektrometrična analiza je pokazala, da sta bila tako Pep1 kot Pep2 močno fosforilirana v RGA v ozadju Ga1 s pomanjkanjem GA. Poleg te študije so fosfoproteomske študije razkrile tudi fosforilacijo Pep1 v RGA, čeprav njena vloga še ni bila raziskana 53, 54, 55. V nasprotju s tem pa fosforilacija Pep2 še ni bila opisana, saj je bilo ta peptid mogoče odkriti le z uporabo transgena RGAGKG. Čeprav je mutacija m1A, ki je odpravila fosforilacijo Pep1, le rahlo zmanjšala aktivnost RGA v rastlinah, je imela v kombinaciji z m2A dodaten učinek pri zmanjšanju aktivnosti RGA (dodatna slika 6). Pomembno je, da je bila fosforilacija Pep1 znatno zmanjšana v mutantu sly1, izboljšanem z GA, v primerjavi z ga1, kar kaže na to, da GA spodbuja defosforilacijo RGA in zmanjšuje njegovo aktivnost. Mehanizem, s katerim GA zavira fosforilacijo RGA, zahteva nadaljnje preiskave. Ena od možnosti je, da se to doseže z regulacijo neidentificirane protein kinaze. Čeprav so študije pokazale, da je ekspresija CK1 protein kinaze EL1 znižana z GA v rižu41, naši rezultati kažejo, da mutacije višjega reda homologa Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ne zmanjšajo fosforilacije RGA. V skladu z našimi rezultati nedavna fosfoproteomska študija z uporabo prekomerno izraženih linij Arabidopsis AEL in trojnega mutanta ael ni identificirala nobenih proteinov DELLA kot substratov teh kinaz56. Ko smo pripravili rokopis, so poročali, da lahko GSK3, gen, ki kodira GSK3/SHAGGY podobno kinazo v pšenici (Triticum aestivum), fosforilira DELLA (Rht-B1b)57, čeprav fosforilacija Rht-B1b z GSK3 ni bila potrjena v rastlinah. In vitro encimske reakcije v prisotnosti GSK3, ki jim je sledila analiza masne spektrometrije, so razkrile tri mesta fosforilacije, ki se nahajajo med domenama DELLA in GRAS Rht-B1b (dopolnilna slika 3). Substitucije serina z alaninom na vseh treh fosforilacijskih mestih so povzročile zmanjšano aktivnost Rht-B1b v transgeni pšenici, kar je skladno z našimi ugotovitvami, da so substitucije alanina v Pep2 RGA zmanjšale aktivnost RGA. Vendar pa so testi razgradnje beljakovin in vitro dodatno pokazali, da lahko fosforilacija stabilizira tudi Rht-B1b57. To je v nasprotju z našimi rezultati, ki kažejo, da alaninske substitucije v Pep2 RGA ne spremenijo njegove stabilnosti v rastlinah. GSK3 v pšenici je ortolog proteina 2 (BIN2), neobčutljivega na brasinosteroide, pri Arabidopsis 57. BIN2 je negativni regulator signalizacije BR in BR aktivira svojo signalno pot tako, da povzroči razgradnjo BIN2 58. Pokazali smo, da zdravljenje z BR ne zmanjša stabilnosti RGA 59 ali ravni fosforilacije pri Arabidopsis (dodatna slika). 2), kar kaže, da je malo verjetno, da bo RGA fosforiliran z BIN2.
Vse kvantitativne podatke smo statistično analizirali z Excelom, značilne razlike pa ugotavljali s Studentovim t-testom. Za vnaprejšnjo določitev velikosti vzorca niso bile uporabljene nobene statistične metode. Noben podatek ni bil izključen iz analize; poskus ni bil randomiziran; in raziskovalci so se zavedali dodelitve med poskusom in oceno rezultatov. Velikosti vzorcev so navedene v legendah slik in v datotekah z neobdelanimi podatki.
Čas objave: 15. aprila 2025