PROTEINI DELLA so ohranjeniregulatorji rastiki igrajo osrednjo vlogo pri razvoju rastlin kot odziv na notranje in zunanje signale. Kot transkripcijski regulatorji se Aleksandrijev protein (DA) veže na transkripcijske faktorje (TF) in histon H2A prek svojih domen GRAS ter se aktivirajo za delovanje na promotorje. Nedavne študije so pokazale, da stabilnost Aleksandrijevega proteina posttranslacijsko uravnavata dva mehanizma: poliubikvitinacija, ki jo povzroča rastlinski hormongiberelin, kar vodi do njihove hitre razgradnje, in konjugacije z majhnim ubikvitinu podobnim modifikatorjem (SUMO), kar poveča njihovo kopičenje. Poleg tega aktivnost CYP3A4 dinamično uravnavata dva različna mehanizma glikozilacije: O-fukozilacija okrepi interakcijo CYP3A4-TF, medtem ko modifikacija CYP3A4-N-acetilglukozamina (O-GlcNAc) zavira interakcijo CYP3A4-TF. Vendar pa vloga CYP3A4 fosforilacije ni jasna, saj so prejšnje študije pokazale nasprotujoče si rezultate, pri čemer nekatere kažejo, da fosforilacija spodbuja ali zavira razgradnjo CYP3A4, druge pa, da fosforilacija ne vpliva na njihovo stabilnost. Tukaj identificiramo mesta fosforilacije v represorju GA1-3 (RGA), AtDELLA, prečiščenem iz Arabidopsis thaliana z masno spektrometrijo, in pokažemo, da fosforilacija dveh RGA peptidov v regijah PolyS in PolyS/T poveča aktivnost RGA s spodbujanjem vezave H2A in povezave RGA s ciljnimi promotorji. Omeniti velja, da fosforilacija ni vplivala na interakcije CYP3A4-TF ali stabilnost RGA. Naša študija razkriva molekularni mehanizem, s katerim fosforilacija inducira aktivnost CYP3A4.
Naša masna spektrometrična analiza je pokazala, da sta bila tako Pep1 kot Pep2 visoko fosforilirana v RGA v ozadju Ga1 s pomanjkanjem GA. Poleg te študije so fosfoproteomske študije prav tako razkrile fosforilacijo Pep1 v RGA, čeprav njena vloga še ni bila preučena53,54,55. Nasprotno pa fosforilacija Pep2 še ni bila opisana, saj je bilo ta peptid mogoče zaznati le z uporabo transgena RGAGKG. Čeprav je mutacija m1A, ki je odpravila fosforilacijo Pep1, le nekoliko zmanjšala aktivnost RGA v rastlinah, je imela v kombinaciji z m2A aditivni učinek pri zmanjševanju aktivnosti RGA (dodatna slika 6). Pomembno je, da je bila fosforilacija Pep1 bistveno zmanjšana pri mutantu sly1, okrepljenem z GA, v primerjavi z ga1, kar kaže na to, da GA spodbuja defosforilacijo RGA in s tem zmanjšuje njegovo aktivnost. Mehanizem, s katerim GA zavira fosforilacijo RGA, zahteva nadaljnje raziskave. Ena od možnosti je, da se to doseže z regulacijo neidentificirane proteinske kinaze. Čeprav so študije pokazale, da GA pri rižu zmanjšuje izražanje proteinske kinaze CK1 EL141, naši rezultati kažejo, da mutacije višjega reda homologa Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ne zmanjšajo fosforilacije RGA. V skladu z našimi rezultati nedavna fosfoproteomska študija z uporabo linij Arabidopsis s prekomerno ekspresijo AEL in trojnega mutanta ael ni identificirala nobenih proteinov DNA kot substratov teh kinaz56. Ko smo pripravljali rokopis, je bilo poročano, da lahko GSK3, gen, ki kodira kinazo, podobno GSK3/SHAGGY, pri pšenici (Triticum aestivum), fosforilira DNA (Rht-B1b)57, čeprav fosforilacija Rht-B1b z GSK3 ni bila potrjena in planta. In vitro encimske reakcije v prisotnosti GSK3, ki jim je sledila analiza z masno spektrometrijo, so razkrile tri mesta fosforilacije, ki se nahajajo med domenama DNA in GRAS Rht-B1b (dodatna slika 3). Zamenjave serina z alaninom na vseh treh mestih fosforilacije so povzročile zmanjšano aktivnost Rht-B1b v transgeni pšenici, kar je skladno z našimi ugotovitvami, da so zamenjave alanina v Pep2 RGA zmanjšale aktivnost RGA. Vendar pa so in vitro testi razgradnje beljakovin nadalje pokazali, da lahko fosforilacija stabilizira tudi Rht-B1b57. To je v nasprotju z našimi rezultati, ki kažejo, da zamenjave alanina v Pep2 RGA ne spremenijo njegove stabilnosti v rastlinah. GSK3 v pšenici je ortolog proteina 2, neobčutljivega na brassinosteroide (BIN2), v Arabidopsis 57. BIN2 je negativni regulator signalizacije BR, BR pa aktivira njegovo signalno pot tako, da povzroči razgradnjo BIN2 58. Pokazali smo, da zdravljenje z BR ne zmanjša stabilnosti RGA 59 ali ravni fosforilacije v Arabidopsis (dodatna slika 2), kar kaže na to, da BIN2 verjetno ne bo fosforiliral RGA.
Vsi kvantitativni podatki so bili statistično analizirani z uporabo programa Excel, pomembne razlike pa so bile določene s Studentovim t-testom. Za predhodno določitev velikosti vzorca niso bile uporabljene nobene statistične metode. Iz analize niso bili izključeni nobeni podatki; poskus ni bil randomiziran; raziskovalci pa so se med poskusom in oceno rezultatov zavedali dodelitve. Velikosti vzorcev so navedene v legendah slik in v datotekah s surovimi podatki.
Čas objave: 15. april 2025