Ta študija je ocenila smrtnost, subletalnost in toksičnost komercialnihcipermetrinformulacije za paglavce brezsrčne vrste. V akutnem testu so bile 96 ur testirane koncentracije 100–800 μg/L. V kroničnem testu so bile naravno prisotne koncentracije cipermetrina (1, 3, 6 in 20 μg/L) testirane na smrtnost, nato pa so 7 dni testirali mikronukleuse in jedrne nepravilnosti rdečih krvničk. LC50 komercialne formulacije cipermetrina za paglavce je bila 273,41 μg L−1. V kroničnem testu je najvišja koncentracija (20 μg L−1) povzročila več kot 50-odstotno smrtnost, saj je ubila polovico testiranih paglavcev. Mikronukleusni test je pokazal pomembne rezultate pri 6 in 20 μg L−1 in odkrili so več jedrnih nepravilnosti, kar kaže, da ima komercialna formulacija cipermetrina genotoksični potencial proti P. gracilis. Cipermetrin predstavlja veliko tveganje za to vrsto, kar kaže, da lahko povzroči številne težave in vpliva na dinamiko tega ekosistema kratkoročno in dolgoročno. Zato lahko sklepamo, da imajo komercialne formulacije cipermetrina toksične učinke na P. gracilis.
Zaradi nenehne širitve kmetijskih dejavnosti in intenzivne uporabezatiranje škodljivcevZaradi ukrepov so vodne živali pogosto izpostavljene pesticidom1,2. Onesnaževanje vodnih virov v bližini kmetijskih polj lahko vpliva na razvoj in preživetje neciljnih organizmov, kot so dvoživke.
Dvoživke postajajo vse pomembnejše pri ocenjevanju okoljskih matric. Anurani veljajo za dobre bioindikatorje onesnaževal okolja zaradi svojih edinstvenih značilnosti, kot so kompleksni življenjski cikli, hitra rast ličink, trofični status, prepustna koža10,11, odvisnost od vode za razmnoževanje12 in nezaščitena jajčeca11,13,14. Mala vodna žaba (Physalaemus gracilis), splošno znana kot jokajoča žaba, se je izkazala za bioindikatorsko vrsto onesnaženja s pesticidi4,5,6,7,15. Vrsta se pojavlja v stoječih vodah, zavarovanih območjih ali območjih s spremenljivim habitatom v Argentini, Urugvaju, Paragvaju in Braziliji1617 in jo IUCN klasifikacija šteje za stabilno zaradi široke razširjenosti in tolerance do različnih habitatov18.
Pri dvoživkah so po izpostavljenosti cipermetrinu poročali o subletalnih učinkih, vključno z vedenjskimi, morfološkimi in biokemičnimi spremembami paglavcev23,24,25, spremenjenim časom umrljivosti in metamorfoze, encimskimi spremembami, zmanjšanim uspehom izleganja24,25, hiperaktivnostjo26, zaviranjem aktivnosti holinesteraze27 in spremembami v plavalnih sposobnostih7,28. Vendar pa so študije genotoksičnih učinkov cipermetrina pri dvoživkah omejene. Zato je pomembno oceniti občutljivost brezrepnih vrst na cipermetrin.
Onesnaženost okolja vpliva na normalno rast in razvoj dvoživk, vendar je najresnejši škodljiv učinek genetska poškodba DNK, ki jo povzroči izpostavljenost pesticidom13. Analiza morfologije krvnih celic je pomemben bioindikator onesnaženosti in potencialne toksičnosti snovi za prostoživeče vrste29. Mikronukleusni test je ena najpogosteje uporabljenih metod za določanje genotoksičnosti kemikalij v okolju30. Je hitra, učinkovita in poceni metoda, ki je dober pokazatelj kemičnega onesnaženosti organizmov, kot so dvoživke31,32, in lahko zagotovi informacije o izpostavljenosti genotoksičnim onesnaževalcem33.
Cilj te študije je bil oceniti toksični potencial komercialnih formulacij cipermetrina za majhne vodne paglavce z uporabo mikronukleusnega testa in ocene ekološkega tveganja.
Kumulativna umrljivost (%) paglavcev vrste P. gracilis, izpostavljenih različnim koncentracijam komercialnega cipermetrina v akutnem obdobju testa.
Kumulativna umrljivost (%) paglavcev vrste P. gracilis, izpostavljenih različnim koncentracijam komercialnega cipermetrina med kroničnim testom.
Visoka umrljivost je bila posledica genotoksičnih učinkov pri dvoživkah, izpostavljenih različnim koncentracijam cipermetrina (6 in 20 μg/L), kar dokazuje prisotnost mikronukleusov (MN) in jedrnih nepravilnosti v eritrocitih. Nastanek MN kaže na napake v mitozi in je povezan s slabo vezavo kromosomov na mikrotubule, napakami v beljakovinskih kompleksih, odgovornih za privzem in transport kromosomov, napakami pri segregaciji kromosomov in napakami pri popravljanju poškodb DNK38,39 ter je lahko povezan z oksidativnim stresom, ki ga povzročajo pesticidi40,41. Pri vseh ocenjenih koncentracijah so opazili tudi druge nepravilnosti. Povečanje koncentracij cipermetrina je povečalo jedrne nepravilnosti v eritrocitih za 5 % oziroma 20 % pri najnižjih (1 μg/L) oziroma najvišjih (20 μg/L) odmerkih. Na primer, spremembe v DNK vrste imajo lahko resne posledice za kratkoročno in dolgoročno preživetje, kar povzroči upad populacije, spremenjeno reproduktivno sposobnost, parjenje v sorodstvu, izgubo genske raznolikosti in spremenjene stopnje migracije. Vsi ti dejavniki lahko vplivajo na preživetje in ohranitev vrste42,43. Nastanek eritroidnih nepravilnosti lahko kaže na blokado citokineze, kar povzroči nenormalno delitev celic (dvojedrni eritrociti)44,45; večrežnjeva jedra so izbokline jedrne membrane z več režnji46, medtem ko so druge eritroidne nepravilnosti lahko povezane z amplifikacijo DNK, kot so jedrne ledvice/mehurčki47. Prisotnost eritrocitov brez jeder lahko kaže na moten transport kisika, zlasti v onesnaženi vodi48,49. Apoptoza kaže na celično smrt50.
Tudi druge študije so pokazale genotoksične učinke cipermetrina. Kabaña in sod.51 so pokazali prisotnost mikronukleusov in jedrnih sprememb, kot so binuklearne celice in apoptotične celice v celicah Odontophrynus americanus po izpostavljenosti visokim koncentracijam cipermetrina (5000 in 10.000 μg L−1) 96 ur. Apoptozo, ki jo povzroča cipermetrin, so odkrili tudi pri P. biligonigerus52 in Rhinella arenarum53. Ti rezultati kažejo, da ima cipermetrin genotoksične učinke na vrsto vodnih organizmov in da je lahko test MN in ENA indikator subletalnih učinkov na dvoživke ter se lahko uporablja za avtohtone vrste in divje populacije, izpostavljene toksinom12.
Komercialne formulacije cipermetrina predstavljajo veliko okoljsko nevarnost (tako akutno kot kronično), saj HQ presegajo raven, ki jo je določila ameriška Agencija za varstvo okolja (EPA)54, kar lahko negativno vpliva na vrsto, če je prisotna v okolju. V oceni kroničnega tveganja je bila NOEC za smrtnost 3 μg L−1, kar potrjuje, da lahko koncentracije v vodi predstavljajo tveganje za vrsto55. Smrtonosna NOEC za ličinke R. arenarum, izpostavljene mešanici endosulfana in cipermetrina, je bila po 168 urah 500 μg L−1; ta vrednost se je po 336 urah zmanjšala na 0,0005 μg L−1. Avtorji kažejo, da daljša izpostavljenost pomeni nižje koncentracije, ki so škodljive za vrsto. Pomembno je tudi poudariti, da so bile vrednosti NOEC višje od vrednosti P. gracilis pri enakem času izpostavljenosti, kar kaže na to, da je odziv vrste na cipermetrin specifičen za vrsto. Poleg tega je vrednost CHQ za P. gracilis po izpostavljenosti cipermetrinu dosegla 64,67, kar je več od referenčne vrednosti, ki jo je določila ameriška Agencija za varstvo okolja54, vrednost CHQ za ličinke R. arenarum pa je bila prav tako višja od te vrednosti (CHQ > 388,00 po 336 urah), kar kaže, da preučevane insekticide predstavljajo veliko tveganje za več vrst dvoživk. Glede na to, da P. gracilis potrebuje približno 30 dni za dokončanje metamorfoze56, lahko sklepamo, da lahko preučevane koncentracije cipermetrina prispevajo k upadu populacije, saj preprečujejo okuženim posameznikom, da bi v zgodnji starosti vstopili v odraslo ali reproduktivno fazo.
V izračunani oceni tveganja za mikronukleuse in druge jedrne nepravilnosti eritrocitov so se vrednosti CHQ gibale od 14,92 do 97,00, kar kaže, da ima cipermetrin potencialno genotoksično tveganje za P. gracilis tudi v njegovem naravnem okolju. Ob upoštevanju smrtnosti je bila najvišja koncentracija ksenobiotičnih spojin, ki jih je P. gracilis prenašal, 4,24 μg L−1. Vendar pa so genotoksične učinke pokazale tudi koncentracije, nizke do 1 μg/L. To dejstvo lahko povzroči povečanje števila nenormalnih osebkov57 in vpliva na razvoj in razmnoževanje vrst v njihovih habitatih, kar povzroči upad populacij dvoživk.
Komercialne formulacije insekticida cipermetrina so pokazale visoko akutno in kronično toksičnost za P. gracilis. Opazili so višje stopnje umrljivosti, verjetno zaradi toksičnih učinkov, kar dokazuje prisotnost mikronukleusov in jedrnih nepravilnosti eritrocitov, zlasti nazobčanih jeder, režnjatih jeder in vezikularnih jeder. Poleg tega so preučevane vrste pokazale povečana okoljska tveganja, tako akutna kot kronična. Ti podatki, skupaj s prejšnjimi študijami naše raziskovalne skupine, so pokazali, da so tudi različne komercialne formulacije cipermetrina še vedno povzročale zmanjšano aktivnost acetilholinesteraze (AChE) in butirilholinesteraze (BChE) ter oksidativni stres58 ter povzročile spremembe v plavalni aktivnosti in ustne malformacije59 pri P. gracilis, kar kaže, da imajo komercialne formulacije cipermetrina visoko smrtonosno in subsmrtonosno toksičnost za to vrsto. Hartmann in sod.60 so ugotovili, da so bile komercialne formulacije cipermetrina najbolj strupene za P. gracilis in drugo vrsto istega rodu (P. cuvieri) v primerjavi z devetimi drugimi pesticidi. To kaže, da lahko zakonsko odobrene koncentracije cipermetrina za varstvo okolja povzročijo visoko umrljivost in dolgoročni upad populacije.
Potrebne so nadaljnje študije za oceno toksičnosti pesticida za dvoživke, saj lahko koncentracije v okolju povzročijo visoko smrtnost in predstavljajo potencialno tveganje za P. gracilis. Spodbujati je treba raziskave dvoživk, saj je podatkov o teh organizmih malo, zlasti o brazilskih vrstah.
Test kronične toksičnosti je trajal 168 ur (7 dni) v statičnih pogojih, subletalne koncentracije pa so bile: 1, 3, 6 in 20 μg ai L−1. V obeh poskusih je bilo ocenjenih 10 paglavcev na tretirano skupino s šestimi ponovitvami, kar skupaj znaša 60 paglavcev na koncentracijo. Medtem je obdelava samo z vodo služila kot negativna kontrola. Vsaka poskusna postavitev je bila sestavljena iz sterilne steklene posode s prostornino 500 ml in gostoto 1 paglavca na 50 ml raztopine. Bučka je bila prekrita s polietilensko folijo, da se prepreči izhlapevanje, in je bila nenehno prezračevana.
Voda je bila kemično analizirana za določitev koncentracij pesticidov pri 0, 96 in 168 urah. Po podatkih Sabina in sodelavcev68 ter Martinsa in sodelavcev69 so bile analize opravljene v Laboratoriju za analizo pesticidov (LARP) Zvezne univerze Santa Maria z uporabo plinske kromatografije v povezavi s trojno kvadrupolno masno spektrometrijo (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornija, ZDA). Kvantitativna določitev pesticidov v vodi je prikazana kot dodatno gradivo (tabela SM1).
Za mikronukleusni test (MNT) in test jedrnih nepravilnosti rdečih krvničk (RNA) je bilo analiziranih 15 paglavcev iz vsake tretirane skupine. Paglavce so anestezirali s 5 % lidokainom (50 mg g-170), vzorce krvi pa so odvzeli s srčno punkcijo z uporabo hepariniziranih brizg za enkratno uporabo. Krvne razmaze so pripravili na sterilnih mikroskopskih stekelcih, jih posušili na zraku, fiksirali s 100 % metanolom (4 °C) 2 minuti in nato 15 minut obarvali z 10 % raztopino Giemsa v temi. Na koncu postopka so stekelca sprali z destilirano vodo, da so odstranili odvečno barvilo, in posušili pri sobni temperaturi.
Vsaj 1000 eritrocitov iz vsakega paglavca je bilo analiziranih z mikroskopom s 100-kratno povečavo in objektivom 71, da bi ugotovili prisotnost MN in ENA. Skupno je bilo ocenjenih 75.796 eritrocitov iz paglavcev glede na koncentracije cipermetrina in kontrolne skupine. Genotoksičnost je bila analizirana po metodi Carrasca in sodelavcev ter Fenecha in sodelavcev38,72 z določitvijo pogostosti naslednjih jedrnih lezij: (1) anuklearne celice: celice brez jeder; (2) apoptotične celice: fragmentacija jedra, programirana celična smrt; (3) binuklearne celice: celice z dvema jedroma; (4) jedrni popki ali mehurčkaste celice: celice z jedri z majhnimi izboklinami jedrne membrane, mehurčki podobne velikosti kot mikrojedra; (5) kariolizirane celice: celice samo z obrisom jedra brez notranje snovi; (6) zarezane celice: celice z jedri z očitnimi razpokami ali zarezami v njihovi obliki, imenovane tudi jedra v obliki ledvice; (7) režnjaste celice: celice z jedrnimi izrastki, večjimi od zgoraj omenjenih veziklov; in (8) mikrocelice: celice s kondenziranimi jedri in zmanjšano citoplazmo. Spremembe so bile primerjane z rezultati negativne kontrole.
Rezultati testov akutne toksičnosti (LC50) so bili analizirani z uporabo programske opreme GBasic in metode TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Podatki kroničnih testov so bili predhodno testirani na normalnost napake (Shapiro-Wilks) in homogenost variance (Bartlett). Rezultati so bili analizirani z enosmerno analizo variance (ANOVA). Za primerjavo podatkov med seboj je bil uporabljen Tukeyjev test, za primerjavo podatkov med tretirano skupino in negativno kontrolno skupino pa Dunnettov test.
Podatki LOEC in NOEC so bili analizirani z Dunnettovim testom. Statistični testi so bili izvedeni s programsko opremo Statistica 8.0 (StatSoft) s stopnjo pomembnosti 95 % (p < 0,05).
Čas objave: 13. marec 2025