Ta študija je ocenila smrtnost, subletalnost in toksičnost komercialnegacipermetrinformulacije za anuranove paglavce. Pri akutnem testu so bile 96 ur testirane koncentracije 100–800 μg/L. Pri kroničnem testu so bile naravno prisotne koncentracije cipermetrina (1, 3, 6 in 20 μg/L) testirane na smrtnost, čemur je sledilo testiranje mikronukleusa in jedrnih nenormalnosti rdečih krvnih celic 7 dni. LC50 komercialne formulacije cipermetrina za paglavce je bil 273,41 μg L-1. V kroničnem testu je najvišja koncentracija (20 μg L−1) povzročila več kot 50-odstotno smrtnost, saj je ubila polovico testiranih paglavcev. Mikronukleusni test je pokazal pomembne rezultate pri 6 in 20 μg L-1 in odkritih je bilo več jedrskih nenormalnosti, kar kaže, da ima komercialna formulacija cipermetrina genotoksični potencial proti P. gracilis. Cipermetrin je visoko tveganje za to vrsto, kar kaže, da lahko povzroči številne težave in vpliva na dinamiko tega ekosistema kratkoročno in dolgoročno. Zato je mogoče sklepati, da imajo komercialne formulacije cipermetrina toksične učinke na P. gracilis.
Zaradi nenehnega širjenja kmetijskih dejavnosti in intenzivne uporabezatiranje škodljivcevvodne živali so pogosto izpostavljene pesticidom1,2. Onesnaženje vodnih virov v bližini kmetijskih polj lahko vpliva na razvoj in preživetje neciljnih organizmov, kot so dvoživke.
Dvoživke postajajo vse bolj pomembne pri ocenjevanju okoljskih matrik. Anurani veljajo za dobre bioindikatorje onesnaževal okolja zaradi svojih edinstvenih značilnosti, kot so zapleteni življenjski cikli, hitre stopnje rasti ličink, trofični status, prepustna koža 10, 11, odvisnost od vode za razmnoževanje 12 in nezaščitena jajca 11, 13, 14. Mala vodna žaba (Physalaemus gracilis), splošno znana kot jokajoča žaba, se je izkazala za bioindikatorsko vrsto onesnaženosti s pesticidi4,5,6,7,15. Vrsto najdemo v stoječih vodah, zavarovanih območjih ali območjih s spremenljivim habitatom v Argentini, Urugvaju, Paragvaju in Braziliji1617, po klasifikaciji IUCN pa velja za stabilno zaradi široke razširjenosti in tolerance različnih habitatov18.
Pri dvoživkah so poročali o subletalnih učinkih po izpostavljenosti cipermetrinu, vključno z vedenjskimi, morfološkimi in biokemičnimi spremembami pri paglavcih 23, 24, 25, spremenjeno umrljivostjo in časom metamorfoze, encimskimi spremembami, zmanjšanim uspehom izvalitve 24, 25, hiperaktivnostjo 26, zaviranjem aktivnosti holinesteraze 27 in spremembami v plavalni zmogljivosti 7, 28. Vendar so študije o genotoksičnih učinkih cipermetrina pri dvoživkah omejene. Zato je pomembno oceniti občutljivost vrst anuranov na cipermetrin.
Onesnaženost okolja vpliva na normalno rast in razvoj dvoživk, vendar je najresnejši škodljiv učinek genetska poškodba DNK, ki jo povzroči izpostavljenost pesticidom13. Analiza morfologije krvnih celic je pomemben bioindikator onesnaženosti in potencialne toksičnosti snovi za divje vrste29. Mikronukleusni test je ena najpogosteje uporabljenih metod za ugotavljanje genotoksičnosti kemikalij v okolju30. Je hitra, učinkovita in poceni metoda, ki je dober pokazatelj kemičnega onesnaženja organizmov, kot so dvoživke31,32, in lahko zagotovi informacije o izpostavljenosti genotoksičnim onesnaževalom33.
Cilj te študije je bil oceniti toksični potencial komercialnih formulacij cipermetrina za majhne vodne paglavce z uporabo mikronukleusnega testa in ocene ekološkega tveganja.
Kumulativna smrtnost (%) paglavcev P. gracilis, izpostavljenih različnim koncentracijam komercialnega cipermetrina v akutnem obdobju testa.
Kumulativna smrtnost (%) paglavcev P. gracilis, izpostavljenih različnim koncentracijam komercialnega cipermetrina med kroničnim testom.
Opažena visoka smrtnost je bila posledica genotoksičnih učinkov pri dvoživkah, ki so bile izpostavljene različnim koncentracijam cipermetrina (6 in 20 µg/L), kar dokazuje prisotnost mikronukleusov (MN) in jedrnih nepravilnosti v eritrocitih. Tvorba MN kaže na napake v mitozi in je povezana s slabo vezavo kromosomov na mikrotubule, okvarami v proteinskih kompleksih, ki so odgovorni za privzem in transport kromosomov, napake v segregaciji kromosomov in napake pri popravljanju poškodb DNA 38, 39 in so lahko povezane z oksidativnim stresom, ki ga povzročajo pesticidi 40, 41. Druge nenormalnosti so opazili pri vseh ocenjenih koncentracijah. Naraščajoče koncentracije cipermetrina so povečale jedrske nenormalnosti v eritrocitih za 5 % oziroma 20 % pri najnižjih (1 μg/L) oziroma najvišjih (20 μg/L) odmerkih. Na primer, spremembe v DNK vrste imajo lahko resne posledice za kratkoročno in dolgoročno preživetje, kar ima za posledico upad populacije, spremenjeno reproduktivno sposobnost, parjenje v sorodstvu, izgubo genetske raznovrstnosti in spremenjene stopnje selitve. Vsi ti dejavniki lahko vplivajo na preživetje in vzdrževanje vrste42,43. Tvorba eritroidnih nenormalnosti lahko kaže na blokado citokineze, kar povzroči nenormalno delitev celic (dvojedrni eritrociti)44,45; multilobed jedra so izbokline jedrske membrane z več režnji46, medtem ko so lahko druge eritroidne nenormalnosti povezane z ojačanjem DNK, kot so jedrske ledvice/mehurčki47. Prisotnost brezjedrnih eritrocitov lahko kaže na oslabljen transport kisika, zlasti v onesnaženi vodi48,49. Apoptoza kaže celično smrt50.
Tudi druge študije so dokazale genotoksične učinke cipermetrina. Kabaña et al.51 je dokazal prisotnost mikronukleusov in jedrskih sprememb, kot so dvojedrne celice in apoptotične celice v celicah Odontophrynus americanus po izpostavljenosti visokim koncentracijam cipermetrina (5000 in 10.000 μg L-1) za 96 ur. S cipermetrinom povzročeno apoptozo so odkrili tudi pri P. biligonigerus52 in Rhinella arenarum53. Ti rezultati kažejo, da ima cipermetrin genotoksične učinke na vrsto vodnih organizmov in da sta preizkusa MN in ENA lahko indikator subletalnih učinkov na dvoživke in se lahko uporabljata za domorodne vrste in divje populacije, izpostavljene strupenim snovem12.
Komercialne formulacije cipermetrina predstavljajo veliko nevarnost za okolje (tako akutno kot kronično), pri čemer HQ presega raven Agencije za varstvo okolja ZDA (EPA)54, ki lahko škodljivo vpliva na vrsto, če je prisotna v okolju. V oceni kroničnega tveganja je bil NOEC za umrljivost 3 μg L−1, kar potrjuje, da lahko koncentracije v vodi predstavljajo tveganje za vrsto55. Letalni NOEC za ličinke R. arenarum, izpostavljene mešanici endosulfana in cipermetrina, je bil 500 μg L-1 po 168 urah; ta vrednost se je po 336 urah zmanjšala na 0,0005 μg L−1. Avtorji kažejo, da daljša kot je izpostavljenost, nižje so koncentracije, ki so škodljive za vrsto. Pomembno je tudi poudariti, da so bile vrednosti NOEC višje od vrednosti P. gracilis pri istem času izpostavljenosti, kar kaže, da je odziv vrste na cipermetrin specifičen za vrsto. Poleg tega je v smislu umrljivosti vrednost CHQ P. gracilis po izpostavljenosti cipermetrinu dosegla 64,67, kar je višje od referenčne vrednosti, ki jo je določila Agencija za varstvo okolja ZDA54, vrednost CHQ ličink R. arenarum pa je bila prav tako višja od te vrednosti (CHQ > 388,00 po 336 urah), kar kaže, da proučevani insekticidi predstavljajo veliko tveganje za več vrsta dvoživk. Glede na to, da P. gracilis potrebuje približno 30 dni za dokončanje metamorfoze56, lahko sklepamo, da lahko proučevane koncentracije cipermetrina prispevajo k upadu populacije s preprečevanjem, da bi okuženi posamezniki zgodaj vstopili v odraslo ali reproduktivno fazo.
V izračunani oceni tveganja mikronukleusov in drugih jedrskih nenormalnosti eritrocitov so bile vrednosti CHQ v razponu od 14,92 do 97,00, kar kaže, da je imel cipermetrin potencialno genotoksično tveganje za P. gracilis tudi v njegovem naravnem habitatu. Ob upoštevanju smrtnosti je bila najvišja koncentracija ksenobiotičnih spojin, ki jo P. gracilis prenaša, 4,24 μg L−1. Vendar pa so koncentracije tako nizke kot 1 μg/L pokazale tudi genotoksične učinke. To dejstvo lahko privede do povečanja števila nenormalnih osebkov57 in vpliva na razvoj in razmnoževanje vrst v njihovih habitatih, kar vodi v upad populacij dvoživk.
Komercialne formulacije insekticida cipermetrin so pokazale visoko akutno in kronično toksičnost za P. gracilis. Opažene so bile višje stopnje umrljivosti, verjetno zaradi toksičnih učinkov, kar dokazuje prisotnost mikronukleusov in jedrskih nepravilnosti eritrocitov, zlasti nazobčanih jeder, lobed jeder in vezikularnih jeder. Poleg tega so proučevane vrste pokazale povečana okoljska tveganja, tako akutna kot kronična. Ti podatki, združeni s prejšnjimi študijami naše raziskovalne skupine, so pokazali, da tudi različne komercialne formulacije cipermetrina še vedno povzročajo zmanjšano aktivnost acetilholinesteraze (AChE) in butirilholinesteraze (BChE) ter oksidativni stres58 ter povzročajo spremembe v plavalni aktivnosti in oralnih malformacijah59 pri P. gracilis, kar kaže, da imajo komercialne formulacije cipermetrina visoko smrtno in subletalno toksičnost za to. vrste. Hartmann et al. 60 so ugotovili, da so komercialne formulacije cipermetrina najbolj strupene za P. gracilis in drugo vrsto istega rodu (P. cuvieri) v primerjavi z devetimi drugimi pesticidi. To nakazuje, da lahko zakonsko dovoljene koncentracije cipermetrina za varstvo okolja povzročijo visoko smrtnost in dolgoročno zmanjšanje populacije.
Potrebne so nadaljnje študije za oceno toksičnosti pesticida za dvoživke, saj lahko koncentracije v okolju povzročijo visoko smrtnost in predstavljajo potencialno tveganje za P. gracilis. Treba je spodbujati raziskave vrst dvoživk, saj je podatkov o teh organizmih malo, zlasti o brazilskih vrstah.
Test kronične toksičnosti je trajal 168 h (7 dni) v statičnih pogojih, subletalne koncentracije pa so bile: 1, 3, 6 in 20 μg ai L−1. V obeh poskusih je bilo 10 paglavcev na tretirano skupino ocenjenih s šestimi ponovitvami, za skupno 60 paglavcev na koncentracijo. Medtem je obdelava samo z vodo služila kot negativna kontrola. Vsaka eksperimentalna postavitev je bila sestavljena iz sterilne steklene posode s prostornino 500 ml in gostoto 1 paglavca na 50 ml raztopine. Bučko smo pokrili s polietilensko folijo, da preprečimo izhlapevanje, in jo nenehno zračili.
Vodo smo kemično analizirali za določitev koncentracije pesticidov pri 0, 96 in 168 urah. Po mnenju Sabina et al. 68 in Martins et al. 69 so bile analize izvedene v Laboratoriju za analizo pesticidov (LARP) Zvezne univerze Santa Maria z uporabo plinske kromatografije, povezane s trojno kvadrupolno masno spektrometrijo (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornija, ZDA). Kvantitativno določanje pesticidov v vodi je prikazano kot dopolnilni material (tabela SM1).
Za mikronukleusni test (MNT) in test jedrskih nenormalnosti rdečih krvnih celic (RNA) je bilo analiziranih 15 paglavcev iz vsake tretirane skupine. Paglavce smo anestezirali s 5% lidokainom (50 mg g-170) in vzorce krvi zbrali s srčno punkcijo z uporabo hepariniziranih brizg za enkratno uporabo. Krvne razmaze smo pripravili na sterilnih mikroskopskih stekelcih, jih posušili na zraku, fiksirali s 100% metanolom (4 °C) 2 minuti in nato obarvali z 10% raztopino Giemsa 15 minut v temi. Na koncu postopka stekelca speremo z destilirano vodo, da odstranimo odvečno madež in posušimo pri sobni temperaturi.
Vsaj 1000 eritrocitov iz vsakega paglavca je bilo analiziranih z uporabo 100 × mikroskopa z 71 objektivom za določitev prisotnosti MN in ENA. Skupaj 75.796 eritrocitov iz paglavcev je bilo ovrednotenih ob upoštevanju koncentracij cipermetrina in kontrol. Genotoksičnost smo analizirali po metodi Carrasco et al. in Fenech et al.38,72 z določitvijo pogostnosti naslednjih jedrnih lezij: (1) brezjedrne celice: celice brez jeder; (2) apoptotične celice: jedrska fragmentacija, programirana celična smrt; (3) dvojedrne celice: celice z dvema jedroma; (4) jedrske celice ali mehurčke: celice z jedri z majhnimi izboklinami jedrske membrane, mehurčki, ki so po velikosti podobni mikronukleusom; (5) kariolizirane celice: celice s samo obrisom jedra brez notranjega materiala; (6) celice z zarezami: celice z jedri z očitnimi razpokami ali zarezami v obliki, imenovane tudi ledvičasta jedra; (7) lobulirane celice: celice z jedrnimi izboklinami, večjimi od prej omenjenih veziklov; in (8) mikrocelice: celice s kondenziranimi jedri in zmanjšano citoplazmo. Spremembe smo primerjali z rezultati negativne kontrole.
Rezultati testa akutne toksičnosti (LC50) so bili analizirani s programsko opremo GBasic in metodo TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Podatki kroničnega testa so bili predhodno testirani glede normalnosti napak (Shapiro-Wilks) in homogenosti variance (Bartlett). Rezultate smo analizirali z enosmerno analizo variance (ANOVA). Tukeyev test je bil uporabljen za primerjavo podatkov med seboj, Dunnettov test pa za primerjavo podatkov med zdravljeno skupino in negativno kontrolno skupino.
Podatki LOEC in NOEC so bili analizirani z Dunnettovim testom. Statistični testi so bili izvedeni s programsko opremo Statistica 8.0 (StatSoft) s stopnjo signifikantnosti 95 % (p < 0,05).
Čas objave: 13. marca 2025