Rastlinski in patogeni materiali
Populacijo za kartiranje asociacij sirka, znano kot populacija konverzije sirka (SCP), je zagotovil dr. Pat Brown na Univerzi v Illinoisu (zdaj na UC Davis). Opisana je bila že prej in je zbirka različnih linij, pretvorjenih v neobčutljivost na fotoperiod in manjšo rast, da bi olajšali rast in razvoj rastlin v ameriškem okolju. V tej študiji je bilo uporabljenih 510 linij iz te populacije, vendar zaradi slabe kalivosti in drugih težav s kontrolo kakovosti niso bile vse linije uporabljene pri analizi vseh treh lastnosti. Na koncu so bili za analizo odziva hitina uporabljeni podatki 345 linij, za odziv flg22 472 linij in za odpornost TLS 456.B. cookeiSev LSLP18 je bil pridobljen od dr. Burta Bluhma na Univerzi v Arkansasu.
Merjenje odziva MAMP
V tej študiji sta bila uporabljena dva različna MAMP-a flg22 (katalog Genscript št. RP19986) in hitin. Rastline sirka so gojili v vložkih, položenih na plošče, napolnjene z zemljo (33 % mešanice za rast Sunshine Redi-Earth Pro) v rastlinjaku. Rastline so zalili dan pred odvzemom vzorcev, da bi se izognili dodatni vlagi listov na dan odvzema.
Linije so bile naključno izbrane in zaradi logističnih razlogov posajene v serijah po 60 linij. Za vsako linijo so bili posajeni trije "lončki" z dvema semenoma na linijo. Naslednje serije so bile posajene takoj po obdelavi prejšnje serije, dokler ni bila ocenjena celotna populacija. Za oba MAMP sta bila izvedena dva poskusna sejanja z genotipi, ki so bili v vsakem od obeh sejanj ponovno naključno izbrani.
ROS testi so bili izvedeni, kot je bilo opisano že prej. Na kratko, za vsako linijo je bilo šest semen posajenih v 3 različne lončke. Iz nastalih sadik so bile tri izbrane glede na izenačenost. Sadike, ki so bile videti nenavadno ali so bile bistveno višje ali nižje od večine, niso bile uporabljene. Iz najširšega dela 4. lista treh različnih 15 dni starih rastlin sirka so bili izrezani štirje listni diski s premerom 3 mm. En disk na list iz dveh rastlin in dva diska iz ene rastline, pri čemer je drugi disk služil kot vodna kontrola (glej spodaj). Diski so bili posamično postavljeni na 50 µl H20 v črni 96-jamični plošči, zatesnjeni z aluminijastim tesnilom, da se prepreči izpostavljenost svetlobi, in čez noč shranjeni pri sobni temperaturi. Naslednje jutro je bila pripravljena reakcijska raztopina z uporabo 2 mg/ml kemiluminiscentne sonde L-012 (Wako, kataloška št. 120-04891), 2 mg/ml hrenove peroksidaze (tip VI-A, Sigma-Aldrich, kataloška št. P6782) in 100 mg/ml hitina ali 2 μM Flg22. V tri od štirih vdolbinic je bilo dodanih 50 µl te reakcijske raztopine. Četrta vdolbinica je bila kontrolna, ki ji je bila dodana reakcijska raztopina brez MAMP. V vsako ploščo so bile vključene tudi štiri slepe vdolbinice, ki so vsebovale samo vodo.
Po dodatku reakcijske raztopine je bila luminiscenca izmerjena z uporabo večdetekcijskega bralnika mikroplošč Synergy™ 2 (BioTek) vsaki 2 minuti 1 uro. Bralnik plošč je v tej 1 uri vsaki 2 minuti izvajal meritve luminiscence. Za vsako vdolbinico je bila izračunana vsota vseh 31 odčitkov. Ocenjena vrednost odziva MAMP za vsak genotip je bila izračunana kot (povprečna vrednost luminiscence treh eksperimentalnih vdolbinic – vrednost v simulirani vdolbinici) – povprečna vrednost v slepi vdolbinici. Vrednosti v slepi vdolbinici so bile dosledno blizu nič.
Listni diskiNicotiana benthamiana, ena visoko odzivna linija sirka (SC0003) in ena nizko odzivna linija sirka (PI 6069) sta bili kot kontrolni vrsti za namene nadzora kakovosti vključeni tudi v vsako 96-jamsko ploščo.
B. cookeipriprava inokuluma in inokulacija
B. cookeiInokulum smo pripravili, kot je bilo opisano prej. Na kratko, zrna sirka smo tri dni namakali v vodi, sprali, jih zajeli v 1-litrske erlenmajerice in avtoklavirali eno uro pri 15 psi in 121 °C. Zrna smo nato inokulirali s približno 5 ml maceriranega micelija iz sveže kulture.B. cookeiIzolate LSLP18 in jih pustili 2 tedna pri sobni temperaturi, pri čemer smo bučke stresali vsake 3 dni. Po 2 tednih so zrna sirka, okužena z glivo, posušili na zraku in nato shranili pri 4 °C do inokulacije na polju. Isti inokulum je bil uporabljen za celoten poskus in vsako leto svež. Za inokulacijo je bilo 6–10 okuženih zrn nameščenih v vrtinec 4–5 tednov starih rastlin sirka. Spore, ki jih proizvajajo te glive, so v enem tednu sprožile okužbo pri mladih rastlinah sirka.
Priprava semen
Pred sajenjem na polje so bila semena sirka tretirana z mešanico fungicida, insekticida in varovala, ki je vsebovala ~ 1 % fungicida Spirato 480 FS, 4 % fungicida Sebring 480 FS in 3 % varovala za semena Sorpro 940 ES. Nato so bila semena 3 dni sušena na zraku, kar je zagotovilo tanko plast te mešanice okoli semen. Varovalo je omogočilo uporabo herbicida Dual Magnum kot tretiranje pred vznikom.
Ocena odpornosti na ciljno listno pegavost
Sirek je bil posajen na Centralni raziskovalni postaji za poljščine v Claytonu v Severni Karolini 14. in 15. junija 2017 ter 20. junija 2018 po randomiziranem blokovnem načrtu z dvema poskusnima ponovitvama v vsakem primeru. Poskusi so bili posajeni v 1,8 m dolge posamezne vrste s širino vrste 0,9 m, pri čemer je bilo na parcelo posajenih 10 semen. Okoli oboda vsakega poskusa sta bili posajeni dve robni vrsti, da se preprečijo robni učinki. Poskusi so bili inokulirani 20. julija 2017 in 20. julija 2018, ko so bile rastline sirka v 3. fazi rasti. Ocene so bile opravljene na lestvici od 1 do 9, kjer so bile rastline, ki niso kazale znakov bolezni, ocenjene z devet, popolnoma mrtve rastline pa z ena. Leta 2017 sta bili opravljeni dve oceni, leta 2018 pa štiri meritve, začenši dva tedna po inokulaciji vsako leto. sAUDPC (standardizirana površina pod krivuljo napredovanja bolezni) je bila izračunana, kot je opisano prej.
Čas objave: 1. april 2021