Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljše rezultate priporočamo, da uporabite novejšo različico brskalnika (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem, da bi zagotovili stalno podporo, spletno mesto prikazujemo brez stiliziranja ali JavaScripta.
Fungicidi se pogosto uporabljajo med cvetenjem sadnega drevja in lahko ogrozijo žuželke opraševalce. Vendar pa je malo znanega o tem, kako se nečebelji opraševalci (npr. samotarske čebele, Osmia cornifrons) odzivajo na kontaktne in sistemske fungicide, ki se pogosto uporabljajo na jablanah med cvetenjem. Ta vrzel v znanju omejuje regulativne odločitve, ki določajo varne koncentracije in čas škropljenja s fungicidi. Ocenili smo učinke dveh kontaktnih fungicidov (kaptan in mankozeb) in štirih medplastnih/fitosistemskih fungicidov (ciprociklin, miklobutanil, pirostrobin in trifloksistrobin). Vplivi na pridobivanje teže ličink, preživetje, razmerje med spoloma in bakterijsko raznolikost. Vrednotenje je bilo izvedeno z uporabo kroničnega oralnega biološkega testa, pri katerem je bil cvetni prah tretiran v treh odmerkih na podlagi trenutno priporočenega odmerka za uporabo na polju (1X), polovičnega odmerka (0,5X) in nizkega odmerka (0,1X). Vsi odmerki mankozeba in piritizolina so znatno zmanjšali telesno težo in preživetje ličink. Nato smo sekvencirali gen 16S, da bi karakterizirali ličinkni bakteriom mankozeba, fungicida, ki je odgovoren za najvišjo smrtnost. Ugotovili smo, da sta se bakterijska raznolikost in številčnost znatno zmanjšali pri ličinkah, ki so se hranile s cvetnim prahom, tretiranim z mankozebom. Naši laboratorijski rezultati kažejo, da je škropljenje nekaterih od teh fungicidov med cvetenjem še posebej škodljivo za zdravje O. cornifrons. Te informacije so pomembne za prihodnje odločitve o upravljanju v zvezi s trajnostno uporabo sredstev za zaščito sadnega drevja in služijo kot osnova za regulativne procese, namenjene zaščiti opraševalcev.
Samotarska čebela zidarica Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) je bila v Združene države Amerike vnesena iz Japonske konec sedemdesetih in v začetku osemdesetih let prejšnjega stoletja, od takrat pa ima vrsta pomembno vlogo opraševalca v upravljanih ekosistemih. Naturalizirane populacije te čebele so del približno 50 vrst divjih čebel, ki dopolnjujejo čebele, ki oprašujejo nasade mandljev in jablan v Združenih državah Amerike2,3. Zidarske čebele se soočajo s številnimi izzivi, vključno z razdrobljenostjo habitata, patogeni in pesticidi3,4. Med insekticidi fungicidi zmanjšujejo pridobivanje energije, iskanje hrane5 in telesno kondicijo6,7. Čeprav nedavne raziskave kažejo, da na zdravje zidarskih čebel neposredno vplivajo komenzalni in ektobaktni mikroorganizmi,8,9 ker lahko bakterije in glive vplivajo na prehrano in imunski odziv, se učinki izpostavljenosti fungicidom na mikrobno raznolikost zidarskih čebel šele začenjajo preučevati.
V sadovnjakih se pred in med cvetenjem škropijo fungicidi z različnimi učinki (kontaktni in sistemski) za zdravljenje bolezni, kot so jabolčna krasta, grenka gniloba, rjava gniloba in pepelasta plesen10,11. Fungicidi veljajo za neškodljive za opraševalce, zato jih priporočamo vrtnarjem v času cvetenja; Izpostavljenost in zaužitje teh fungicidov s strani čebel je relativno dobro znano, saj je to del postopka registracije pesticidov s strani Agencije za varstvo okolja ZDA in številnih drugih nacionalnih regulativnih agencij12,13,14. Vendar pa so učinki fungicidov na nečebele manj znani, ker jih v Združenih državah Amerike ne zahtevajo sporazumi o dovoljenju za promet15. Poleg tega na splošno ni standardiziranih protokolov za testiranje posameznih čebel16,17, vzdrževanje kolonij, ki zagotavljajo čebele za testiranje, pa je izziv18. V Evropi in ZDA se vse pogosteje izvajajo poskusi z različnimi upravljanimi čebelami za preučevanje učinkov pesticidov na divje čebele, pred kratkim pa so bili razviti standardizirani protokoli za O. cornifrons19.
Rogate čebele so monociti in se komercialno uporabljajo v krapovskih kulturah kot dopolnilo ali nadomestilo za medonosne čebele. Te čebele se pojavijo med marcem in aprilom, pri čemer se prezgodnji samci pojavijo tri do štiri dni pred samicami. Po parjenju samica aktivno zbira cvetni prah in nektar, da zagotovi vrsto zalegel v cevasti votlini gnezda (naravnem ali umetnem)1,20. Jajčeca odložijo na cvetni prah znotraj celic; samica nato zgradi glineno steno, preden pripravi naslednjo celico. Ličinke prvega stadija so zaprte v horionu in se hranijo z zarodnimi tekočinami. Od drugega do petega stadija (predbuka) se ličinke hranijo s cvetnim prahom22. Ko je zaloga cvetnega prahu popolnoma izčrpana, ličinke tvorijo kokone, se zabubijo in se pojavijo kot odrasle osebe v istem zalegelu, običajno pozno poleti20,23. Odrasle osebe se pojavijo naslednjo pomlad. Preživetje odraslih je povezano z neto pridobitvijo energije (pridobivanjem teže) glede na vnos hrane. Tako so prehranska kakovost cvetnega prahu, pa tudi drugi dejavniki, kot sta vreme ali izpostavljenost pesticidom, odločilni dejavniki preživetja in zdravja24.
Insekticidi in fungicidi, ki se uporabljajo pred cvetenjem, se lahko v različni meri premikajo znotraj rastlinskega žilja, od translaminarnih (npr. se lahko premikajo z zgornje površine listov na spodnjo površino, kot nekateri fungicidi) 25 do resnično sistemskih učinkov. , ki lahko prodrejo v krošnjo iz korenin, lahko vstopijo v nektar cvetov jablane 26, kjer lahko ubijejo odrasle O. cornifrons 27. Nekateri pesticidi se izlužujejo tudi v cvetni prah, kar vpliva na razvoj ličink koruze in povzroči njihovo smrt 19. Druge študije so pokazale, da lahko nekateri fungicidi bistveno spremenijo gnezditveno vedenje sorodne vrste O. lignaria 28. Poleg tega so laboratorijske in terenske študije, ki simulirajo scenarije izpostavljenosti pesticidom (vključno s fungicidi), pokazale, da pesticidi negativno vplivajo na fiziologijo 22 morfologijo 29 in preživetje medonosnih čebel in nekaterih samotarskih čebel. Različna fungicidna pršila, ki se uporabljajo neposredno na odprte cvetove med cvetenjem, lahko kontaminirajo cvetni prah, ki ga odrasle čebele naberejo za razvoj ličink, katerih učinke je treba še preučiti 30.
Vedno bolj se prepoznava, da na razvoj ličink vplivajo cvetni prah in mikrobne združbe prebavnega sistema. Mikrobiom medonosne čebele vpliva na parametre, kot so telesna masa31, presnovne spremembe22 in dovzetnost za patogene32. Prejšnje študije so preučevale vpliv razvojne faze, hranil in okolja na mikrobiom samotarskih čebel. Te študije so razkrile podobnosti v strukturi in številčnosti ličink in cvetnega prahu33, pa tudi najpogostejših bakterijskih rodov Pseudomonas in Delftia med vrstami samotarskih čebel. Vendar pa so fungicidi, čeprav so bili povezani s strategijami za zaščito zdravja čebel, učinki fungicidov na ličinkov mikrobioto z neposredno oralno izpostavljenostjo ostajajo neraziskani.
V tej študiji so preizkušali učinke resničnih odmerkov šestih pogosto uporabljenih fungicidov, registriranih za uporabo na sadnem drevju v Združenih državah Amerike, vključno s kontaktnimi in sistemskimi fungicidi, ki so bili peroralno aplicirani ličinkam koruznega roga iz kontaminirane hrane. Ugotovili smo, da so kontaktni in sistemski fungicidi zmanjšali pridobivanje telesne teže čebel in povečali umrljivost, pri čemer so bili najhujši učinki povezani z mankozebom in piritiopidom. Nato smo primerjali mikrobno raznolikost ličink, ki so se hranile s prehrano s cvetnim prahom, tretirano z mankozebom, s tistimi, ki so se hranile s kontrolno prehrano. Obravnavali smo možne mehanizme, ki so podlaga za umrljivost, in posledice za programe integriranega zatiranja škodljivcev in opraševalcev (IPPM)36.
Odrasle osebke O. cornifrons, ki so prezimile v kokonih, so pridobili iz Centra za raziskave sadja v Biglervillu v Pensilvaniji in jih shranili pri temperaturi od -3 do 2 °C (±0,3 °C). Pred poskusom (skupaj 600 kokonov). Maja 2022 so 100 kokonov O. cornifrons dnevno prenesli v plastične skodelice (50 kokonov na skodelico, DI dolžine 5 cm × 15 cm), v skodelice pa so dali robčke, da so spodbudili odpiranje in zagotovili žvečljiv substrat, kar je zmanjšalo stres za kamenske čebele37. Dve plastični skodelici s kokoni smo postavili v kletko za žuželke (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Tajvan) z 10 ml podajalniki, ki vsebujejo 50 % raztopino saharoze, in jih shranili štiri dni, da se zagotovi zaprtje in parjenje. 23 °C, relativna vlažnost 60 %, fotoperioda 10 l (nizka intenzivnost): 14 dni. V času največjega cvetenja jablan so vsako jutro šest dni (100 na dan) izpustili 100 parjenih samic in samcev v dve umetni gnezdi (gnezdo-pasti: širina 33,66 × višina 30,48 × dolžina 46,99 cm; dodatna slika 1). Postavljeno v arboretumu Pensilvanije, blizu češnje (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), breskve (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), hruške (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), jablane koronarija (Malus coronaria) in številnih sort jablan (Malus coronaria, Malus), domače jablane 'Co-op 30′ Enterprise™, jablane 'Co-Op 31′ Winecrisp™, begonije 'Freedom', begonije 'Golden Delicious' in begonije 'Nova Spy'). Vsaka modra plastična ptičja hišica se prilega na dva lesena zaboja. Vsaka gnezdilnica je vsebovala 800 praznih cevk iz kraft papirja (spiralno odprte, 0,8 cm notranji premer × 15 cm dolžina) (Jonesville Paper Tube Co., Michigan), vstavljenih v neprozorne celofanske cevke (0,7 zunanji premer glej Plastični čepi (čepi T-1X) zagotavljajo gnezdišča.
Obe gnezdilnici sta bili obrnjeni proti vzhodu in prekriti z zeleno plastično vrtno ograjo (model Everbilt št. 889250EB12, velikost odprtine 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m), da se prepreči dostop glodavcev in ptic, ter postavljeni na površino zemlje poleg gnezdilnic z zemljo. Gnezdilnica (dodatna slika 1a). Jajčeca koruznega vešča smo dnevno zbirali tako, da smo iz gnezd zbrali 30 epruvetk in jih prepeljali v laboratorij. S škarjami smo na koncu epruvete naredili rez, nato pa spiralno cev razstavili, da smo odkrili zalego. Posamezna jajčeca in njihov cvetni prah smo odstranili z ukrivljeno lopatico (komplet orodij Microslide, BioQuip Products Inc., Kalifornija). Jajčeca smo inkubirali na vlažnem filtrirnem papirju in jih pred uporabo v naših poskusih za 2 uri postavili v petrijevko (dodatna slika 1b-d).
V laboratoriju smo ocenili oralno toksičnost šestih fungicidov, uporabljenih pred in med cvetenjem jablan, v treh koncentracijah (0,1X, 0,5X in 1X, kjer je 1X oznaka, uporabljena na 100 galon vode/akru. Visok poljski odmerek = koncentracija na polju). (Tabela 1). Vsaka koncentracija je bila ponovljena 16-krat (n = 16). Dva kontaktna fungicida (Tabela S1: mankozeb 2696,14 ppm in kaptan 2875,88 ppm) in štirje sistemski fungicidi (Tabela S1: piritiostrobin 250,14 ppm; trifloksistrobin 110,06 ppm; miklobutanil azol 75,12 ppm; ciprodinil 280,845 ppm) so pokazali toksičnost za sadje, zelenjavo in okrasne rastline. Cvetni prah smo homogenizirali z mlinčkom, 0,20 g prenesli v vdolbinico (24-vdolbinska plošča Falcon) in dodali ter zmešali 1 μL raztopine fungicida, da smo oblikovali piramidalni cvetni prah z 1 mm globokimi vdolbinicami, v katere smo dali jajčeca. Postavili smo jih z mini lopatico (dodatna slika 1c,d). Plošče Falcon smo shranjevali pri sobni temperaturi (25 °C) in 70 % relativni vlažnosti. Primerjali smo jih s kontrolnimi ličinkami, ki so se hranile s homogeno dieto s cvetnim prahom, obdelano s čisto vodo. Smrtnost smo beležili in težo ličink merili vsak drugi dan, dokler ličinke niso dosegle predbubilne starosti, z uporabo analitične tehtnice (Fisher Scientific, natančnost = 0,0001 g). Nazadnje smo razmerje med spoloma ocenili z odprtjem kokona po 2,5 meseca.
DNK smo ekstrahirali iz celih ličink O. cornifrons (n = 3 na pogoj tretiranja, cvetni prah, tretiran z mankozebom, in neobdelan) in na teh vzorcih smo izvedli analize mikrobne raznolikosti, zlasti ker je bila najvišja umrljivost pri ličinkah mankozeba, ki so prejemale MnZn. DNK smo pomnožili, očistili z uporabo kompleta DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (Zymo Research, Irvine, Kalifornija) in sekvencirali (600 ciklov) na Illumina® MiSeq™ z uporabo kompleta v3. Ciljno sekvenciranje bakterijskih genov 16S ribosomske RNA smo izvedli z uporabo kompleta Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (Zymo Research, Irvine, Kalifornija) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki ciljajo na regijo V3-V4 gena 16S rRNA. Poleg tega smo izvedli sekvenciranje 18S z uporabo 10-odstotne vključitve PhiX, pomnoževanje pa smo izvedli z uporabo para začetnih oligonukleotidov 18S001 in NS4.
Uvozite in obdelajte parne odčitke39 z uporabo cevovoda QIIME2 (v2022.11.1). Ti odčitki so bili obrezani in združeni, himerna zaporedja pa so bila odstranjena z uporabo vtičnika DADA2 v QIIME2 (združevanje šuma qiime dada2)40. Dodelitve razredov 16S in 18S so bile izvedene z uporabo vtičnika za klasifikator objektov Classify-sklearn in predhodno naučenega artefakta silva-138-99-nb-classifier.
Vsi eksperimentalni podatki so bili preverjeni glede normalnosti (Shapiro-Wilks) in homogenosti varianc (Leveneov test). Ker nabor podatkov ni izpolnjeval predpostavk parametrične analize in transformacija ni standardizirala ostankov, smo izvedli neparametrično dvosmerno ANOVA (Kruskal-Wallis) z dvema faktorjema [čas (trifazne časovne točke 2, 5 in 8 dni) in fungicid], da bi ocenili učinek tretiranja na svežo težo ličink, nato pa smo izvedli post hoc neparametrične parne primerjave z uporabo Wilcoxonovega testa. Za primerjavo učinkov fungicidov na preživetje pri treh koncentracijah fungicidov smo uporabili posplošen linearni model (GLM) s Poissonovo porazdelitvijo41,42. Za analizo diferencialne številčnosti smo število variant zaporedja amplikonov (ASV) strnili na raven rodu. Primerjave diferencialne številčnosti med skupinami z uporabo 16S (raven rodu) in relativne številčnosti 18S so bile izvedene z uporabo posplošenega aditivnega modela za položaj, velikost in obliko (GAMLSS) z beta nič napihnjenimi (BEZI) družinskimi porazdelitvami, ki so bile modelirane na makro. v Microbiome R43 (v1.1). 1). Pred diferencialno analizo odstranite mitohondrijske in kloroplastne vrste. Zaradi različnih taksonomskih ravni 18S je bila za diferencialne analize uporabljena le najnižja raven vsakega taksona. Vse statistične analize so bile izvedene z uporabo R (v. 3.4.3., projekt CRAN) (Team 2013).
Izpostavljenost mankozebu, piritiostrobinu in trifloksistrobinu je znatno zmanjšala pridobivanje telesne teže pri O. cornifrons (slika 1). Ti učinki so bili dosledno opaženi pri vseh treh ocenjenih odmerkih (slika 1a–c). Ciklostrobin in miklobutanil nista bistveno zmanjšala teže ličink.
Povprečna sveža teža ličink stebelnega vešča, izmerjena v treh časovnih točkah pri štirih prehranskih tretiranjih (homogeno gnojenje s cvetnim prahom + fungicid: kontrola, odmerki 0,1X, 0,5X in 1X). (a) Nizek odmerek (0,1X): prva časovna točka (1. dan): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, druga časovna točka (5. dan): 22,83, DF = 0,0009; tretja časovna točka (8. dan): χ2: 28,39, DF = 6; (b) polovični odmerek (0,5X): prva časovna točka (1. dan): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, druga časovna točka (prvi dan): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; tretja časovna točka (8. dan) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Mesto ali polni odmerek (1X): prva časovna točka (1. dan) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, druga časovna točka (5. dan): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; tretja časovna točka (8. dan): χ2: 28,39, DF = 6; neparametrična analiza variance. Stolpci predstavljajo povprečje ± standardna napaka parnih primerjav (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Pri najnižjem odmerku (0,1X) se je telesna teža ličink zmanjšala za 60 % pri trifloksistrobinu, za 49 % pri mankozebu, za 48 % pri miklobutanilu in za 46 % pri piritistrobinu (slika 1a). Pri izpostavljenosti polovici poljskega odmerka (0,5X) se je telesna teža ličink mankozeba zmanjšala za 86 %, piritiostrobina za 52 % in trifloksistrobina za 50 % (slika 1b). Polni poljski odmerek (1X) mankozeba je zmanjšal težo ličink za 82 %, piritiostrobina za 70 %, trifloksistrobina, miklobutanila in sangarda pa za približno 30 % (slika 1c).
Smrtnost je bila najvišja med ličinkami, ki so se hranile s cvetnim prahom, tretiranim z mankozebom, sledila sta jim piritiostrobin in trifloksistrobin. Smrtnost se je povečevala z naraščajočimi odmerki mankozeba in piritizolina (slika 2; tabela 2). Vendar se je smrtnost koruznega vešča le nekoliko povečala, ko so se koncentracije trifloksistrobina povečevale; ciprodinil in kaptan nista bistveno povečala smrtnosti v primerjavi s kontrolnimi tretiranji.
Smrtnost ličink muhe vešče so primerjali po zaužitju cvetnega prahu, ki je bil individualno tretiran s šestimi različnimi fungicidi. Mankozeb in pentopiramid sta bila bolj občutljiva na oralno izpostavljenost koruznim ličinkam (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (linija, naklon = 0,29, P < 0,001; naklon = 0,24, P < 0,00)).
V povprečju je bilo v vseh zdravljenjih 39,05 % bolnikov žensk in 60,95 % moških. Med kontrolnimi zdravljenji je bil delež žensk 40 % tako v študijah z nizkim odmerkom (0,1X) kot s polovičnim odmerkom (0,5X), v študijah s polnim odmerkom (1X) pa 30 %. Pri odmerku 0,1X je bilo med ličinkami, ki so se hranile s cvetnim prahom in so bile zdravljene z mankozebom in miklobutanilom, 33,33 % odraslih samic, 22 % odraslih samic, 44 % odraslih ličink je bilo samic, 44 % odraslih ličink je bilo samic, 41 % odraslih ličink pa je bilo 31 % v kontrolni skupini (slika 3a). Pri 0,5-kratnem odmerku je bilo v skupini, ki je prejemala mankozeb in piritiostrobin, 33 % odraslih črvov samic, 36 % v skupini, ki je prejemala trifloksistrobin, 41 % v skupini, ki je prejemala miklobutanil, in 46 % v skupini, ki je prejemala ciprostrobin. Ta številka je bila 53 % v skupini, ki je prejemala kaptan, in 38 % v kontrolni skupini (slika 3b). Pri 1-kratnem odmerku je bilo v skupini, ki je prejemala mankozeb, 30 % žensk, 36 % v skupini, ki je prejemala piritiostrobin, 44 % v skupini, ki je prejemala trifloksistrobin, 38 % v skupini, ki je prejemala miklobutanil, in 50 % v kontrolni skupini – 38,5 % žensk (slika 3c).
Odstotek samic in samcev vrtalcev po izpostavljenosti fungicidu v larvalni fazi. (a) Nizek odmerek (0,1X). (b) Polovični odmerek (0,5X). (c) Poljski odmerek ali polni odmerek (1X).
Analiza 16S zaporedja je pokazala, da se je bakterijska skupina razlikovala med ličinkami, hranjenimi s cvetnim prahom, obdelanim z mankozebom, in ličinkami, hranjenimi z neobdelanim cvetnim prahom (slika 4a). Mikrobni indeks netretiranih ličink, hranjenih s cvetnim prahom, je bil višji kot pri ličinkah, hranjenih s cvetnim prahom, obdelanim z mankozebom (slika 4b). Čeprav opažena razlika v bogastvu med skupinami ni bila statistično pomembna, je bila bistveno nižja od tiste, ki smo jo opazili pri ličinkah, hranjenih z neobdelanim cvetnim prahom (slika 4c). Relativna številčnost je pokazala, da je bila mikrobiota ličink, hranjenih s kontrolnim cvetnim prahom, bolj raznolika kot pri ličinkah, hranjenih z ličinkami, obdelanimi z mankozebom (slika 5a). Deskriptivna analiza je pokazala prisotnost 28 rodov v kontrolnih in z mankozebom obdelanih vzorcih (slika 5b). c Analiza z uporabo 18S sekvenciranja ni pokazala pomembnih razlik (dodatna slika 2).
Profili SAV, ki temeljijo na zaporedjih 16S, so bili primerjani s Shannonovim bogastvom in opazovanim bogastvom na ravni debla. (a) Analiza glavnih koordinat (PCoA) na podlagi celotne strukture mikrobne združbe pri netretiranih ličinkah, hranjenih s cvetnim prahom ali kontrolnih (modra) in ličinkah, hranjenih z mankozebom (oranžna). Vsaka podatkovna točka predstavlja ločen vzorec. PCoA je bila izračunana z uporabo Bray-Curtisove razdalje multivariatne t-porazdelitve. Ovali predstavljajo 80-odstotno stopnjo zaupanja. (b) Škatlasti diagram, surovi podatki o Shannonovem bogastvu (točke) in c. Opazovano bogastvo. Škatlasti diagrami prikazujejo polja za srednjo črto, interkvartilni razpon (IQR) in 1,5 × IQR (n = 3).
Sestava mikrobnih združb ličink, ki so se hranile z mankozebom obdelanim in neobdelanim cvetnim prahom. (a) Relativna številčnost mikrobnih rodov pri ličinkah. (b) Toplotni zemljevid identificiranih mikrobnih združb. Delftia (razmerje verjetnosti (OR) = 0,67, P = 0,0030) in Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); Vrstice toplotnega zemljevida so združene v skupine z uporabo korelacijske razdalje in povprečne povezanosti.
Naši rezultati kažejo, da je oralna izpostavljenost kontaktnim (mankozeb) in sistemskim (pirostrobin in trifloksistrobin) fungicidom, ki so se pogosto uporabljali med cvetenjem, znatno zmanjšala pridobivanje teže in povečala umrljivost ličink koruze. Poleg tega je mankozeb znatno zmanjšal raznolikost in bogastvo mikrobioma v predbupolarni fazi. Miklobutanil, drug sistemski fungicid, je pri vseh treh odmerkih znatno zmanjšal pridobivanje telesne teže ličink. Ta učinek je bil očiten v drugi (5. dan) in tretji (8. dan) časovni točki. Nasprotno pa ciprodinil in kaptan nista bistveno zmanjšala pridobivanja teže ali preživetja v primerjavi s kontrolno skupino. Kolikor vemo, je to delo prvo, ki določa učinke poljskih odmerkov različnih fungicidov, ki se uporabljajo za zaščito koruznih posevkov z neposredno izpostavljenostjo cvetnemu prahu.
Vsa tretiranja s fungicidi so znatno zmanjšala pridobivanje telesne teže v primerjavi s kontrolnimi tretiranji. Mankozeb je imel največji učinek na pridobivanje telesne teže ličink s povprečnim zmanjšanjem za 51 %, sledil pa mu je piritiostrobin. Vendar pa druge študije niso poročale o neželenih učinkih poljskih odmerkov fungicidov na ličinke44. Čeprav je bilo dokazano, da imajo ditiokarbamatni biocidi nizko akutno toksičnost45, se etilen bisditiokarbamati (EBDCS), kot je mankozeb, lahko razgradijo v sečnino etilen sulfid. Glede na njegove mutagene učinke pri drugih živalih je ta razgradni produkt lahko odgovoren za opažene učinke46,47. Prejšnje študije so pokazale, da na nastanek etilen tiouree vplivajo dejavniki, kot so povišana temperatura48, raven vlažnosti49 in dolžina skladiščenja izdelka50. Pravilni pogoji skladiščenja biocidov lahko ublažijo te stranske učinke. Poleg tega je Evropska agencija za varnost hrane izrazila zaskrbljenost glede toksičnosti piritiopida, za katerega se je izkazalo, da je rakotvoren za prebavni sistem drugih živali51.
Peroralna uporaba mankozeba, piritiostrobina in trifloksistrobina poveča umrljivost ličink koruznega vešča. Nasprotno pa miklobutanil, ciprociklin in kaptan niso vplivali na umrljivost. Ti rezultati se razlikujejo od rezultatov Ladurnerja in sod.52, ki so pokazali, da kaptan znatno zmanjša preživetje odraslih O. lignaria in Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae). Poleg tega je bilo ugotovljeno, da fungicidi, kot sta kaptan in boskalid, povzročajo umrljivost ličink52,53,54 ali spreminjajo prehranjevalne navade55. Te spremembe lahko posledično vplivajo na prehransko kakovost cvetnega prahu in na koncu na pridobitev energije v larvalni fazi. Umrljivost, opažena v kontrolni skupini, je bila skladna z drugimi študijami 56,57.
Razmerje med spoloma, v katerem imajo samci prednost, ki smo ga opazili v našem delu, je mogoče pojasniti z dejavniki, kot so nezadostno parjenje in slabe vremenske razmere med cvetenjem, kot sta za O. cornuta že predlagala Vicens in Bosch. Čeprav so imeli samice in samci v naši študiji štiri dni za parjenje (obdobje, ki na splošno velja za zadostno za uspešno parjenje), smo namerno zmanjšali intenzivnost svetlobe, da bi zmanjšali stres. Vendar pa lahko ta sprememba nenamerno vpliva na proces parjenja61. Poleg tega čebele doživljajo več dni neugodnega vremena, vključno z dežjem in nizkimi temperaturami (<5 °C), kar lahko negativno vpliva tudi na uspeh parjenja4,23.
Čeprav se je naša študija osredotočila na celoten larvalni mikrobiom, naši rezultati ponujajo vpogled v morebitne odnose med bakterijskimi združbami, ki so lahko ključne za prehrano čebel in izpostavljenost fungicidom. Na primer, ličinke, ki so se hranile z cvetnim prahom, tretiranim z mankozebom, so imele znatno zmanjšano strukturo in številčnost mikrobne združbe v primerjavi z ličinkami, ki so se hranile z neobdelanim cvetnim prahom. Pri ličinkah, ki so uživale neobdelan cvetni prah, sta bili prevladujoči bakterijski skupini Proteobacteria in Actinobacteria, ki sta bili pretežno aerobni ali fakultativno aerobni. Znano je, da imajo bakterije Delft, ki so običajno povezane s samotnimi vrstami čebel, antibiotično delovanje, kar kaže na potencialno zaščitno vlogo pred patogeni. Druga bakterijska vrsta, Pseudomonas, je bila v ličinkah, ki so se hranile z neobdelanim cvetnim prahom, v ličinkah, tretiranih z mankozebom, pa je bila v njej znatno manjša. Naši rezultati podpirajo prejšnje študije, ki so Pseudomonas opredelile kot enega najpogostejših rodov pri O. bicornis35 in drugih samotnih osah34. Čeprav eksperimentalni dokazi o vlogi Pseudomonas pri zdravju O. cornifrons niso bili preučeni, je bilo dokazano, da ta bakterija spodbuja sintezo zaščitnih toksinov pri hrošču Paederus fuscipes in spodbuja presnovo arginina in vitro 35, 65. Ta opažanja kažejo na potencialno vlogo pri virusni in bakterijski obrambi med razvojem ličink O. cornifrons. Microbacterium je še en rod, identificiran v naši študiji, za katerega poročamo, da je v velikem številu prisoten v ličinkah črne vojakinje v pogojih stradanja66. V ličinkah O. cornifrons lahko mikrobakterije prispevajo k ravnovesju in odpornosti črevesnega mikrobioma v stresnih pogojih. Poleg tega se v ličinkah O. cornifrons nahaja Rhodococcus, ki je znan po svojih sposobnostih razstrupljanja67. Ta rod se nahaja tudi v črevesju A. florea, vendar v zelo nizki številčnosti68. Naši rezultati kažejo na prisotnost več genetskih variacij v številnih mikrobnih taksonih, ki lahko spremenijo presnovne procese pri ličinkah. Vendar pa je potrebno boljše razumevanje funkcionalne raznolikosti O. cornifrons.
Skratka, rezultati kažejo, da so mankozeb, piritiostrobin in trifloksistrobin zmanjšali pridobivanje telesne teže in povečali umrljivost ličink koruznega vešča. Čeprav narašča zaskrbljenost glede učinkov fungicidov na opraševalce, je treba bolje razumeti učinke preostalih metabolitov teh spojin. Te rezultate je mogoče vključiti v priporočila za integrirane programe upravljanja opraševalcev, ki kmetom pomagajo preprečiti uporabo določenih fungicidov pred in med cvetenjem sadnega drevja z izbiro fungicidov in spreminjanjem časa nanašanja ali s spodbujanjem uporabe manj škodljivih alternativ 36. Te informacije so pomembne za razvoj priporočil o uporabi pesticidov, kot je prilagajanje obstoječih programov škropljenja in spreminjanje časa škropljenja pri izbiri fungicidov ali spodbujanje uporabe manj nevarnih alternativ. Potrebne so nadaljnje raziskave o škodljivih učinkih fungicidov na razmerje med spoloma, prehranjevalne navade, črevesni mikrobiom in molekularne mehanizme, ki so podlaga za izgubo teže in umrljivost koruznega vešča.
Izvorni podatki 1, 2 in 3 na slikah 1 in 2 so bili deponirani v podatkovnem repozitoriju figshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 in https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. Zaporedja, analizirana v tej študiji (sliki 4, 5), so na voljo v repozitoriju NCBI SRA pod dostopno številko PRJNA1023565.
Bosch, J. in Kemp, WP Razvoj in uveljavitev vrst medonosnih čebel kot opraševalcev kmetijskih pridelkov: primer rodu Osmia. (Hymenoptera: Megachilidae) in sadnega drevja. bull. Ntomore. resource. 92, 3–16 (2002).
Parker, MG et al. Prakse opraševanja in dojemanje alternativnih opraševalcev med pridelovalci jabolk v New Yorku in Pensilvaniji. posodobitev. Kmetijstvo. prehranski sistemi. 35, 1–14 (2020).
Koch I., Lonsdorf EW, Artz DR, Pitts-Singer TL in Ricketts TH Ekologija in ekonomija opraševanja mandljev z uporabo avtohtonih čebel. J. Economics. Ntomore. 111, 16–25 (2018).
Lee, E., He, Y. in Park, Y.-L. Vplivi podnebnih sprememb na fenologijo tragopana: posledice za upravljanje populacije. Climb. Change 150, 305–317 (2018).
Artz, DR in Pitts-Singer, TL Vpliv fungicidnih in adjuvantnih škropiv na gnezditveno vedenje dveh samotarskih čebel (Osmia lignaria in Megachile rotundata). PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. et al. Nizko toksičen fungicid za poljščine (fenbukonazol) moti signale reproduktivne kakovosti samcev, kar povzroči zmanjšan uspeh parjenja pri divjih samotarskih čebelah. J. Apps. ecology. 59, 1596–1607 (2022).
Sgolastra F. et al. Neonikotinoidni insekticidi in biosinteza ergosterola zavirajo sinergistično smrtnost zaradi fungicidov pri treh vrstah čebel. Pest Control. the science. 73, 1236–1243 (2017).
Kuhneman JG, Gillung J, Van Dyck MT, Fordyce RF. in Danforth BN Samotarske ličinke os spreminjajo bakterijsko raznolikost, ki jo cvetni prah zagotavlja čebelam, ki gnezdijo na steblih Osmia cornifrons (Megachilidae). sprednji del. mikroorganizem. 13, 1057626 (2023).
Dharampal PS, Danforth BN in Steffan SA Ektosimbiotski mikroorganizmi v fermentiranem cvetnem prahu so prav tako pomembni za razvoj samotarskih čebel kot sam cvetni prah. ekologija. evolucija. 12. e8788 (2022).
Kelderer M, Manici LM, Caputo F in Thalheimer M. Medvrstna sajenje v nasadih jablan za nadzor bolezni, ki jih povzroča ponovno sejanje: praktična študija učinkovitosti na podlagi mikrobnih indikatorjev. Plant Soil 357, 381–393 (2012).
Martin PL, Kravchik T., Khodadadi F., Achimovich SG in Peter KA Grenka gniloba jabolk v srednjeatlantski regiji Združenih držav Amerike: ocena povzročiteljev in vpliva regionalnih vremenskih razmer ter občutljivosti sort. Fitopatologija 111, 966–981 (2021).
Cullen MG, Thompson LJ, Carolan JK, Stout JK in Stanley DA Fungicidi, herbicidi in čebele: sistematični pregled obstoječih raziskav in metod. PLoS One 14, e0225743 (2019).
Pilling, ED in Jepson, PC Sinergijski učinki fungicidov EBI in piretroidnih insekticidov na čebele (Apis mellifera). Pests the Science. 39, 293–297 (1993).
Mussen, EC, Lopez, JE in Peng, CY Vpliv izbranih fungicidov na rast in razvoj ličink čebelje čebele Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). Sreda. Ntomore. 33, 1151-1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D. in McArt, S. Vodnik za odločanje o uporabi pesticidov za zaščito opraševalcev v sadovnjakih (Univerza Cornell, 2018).
Iwasaki, JM in Hogendoorn, K. Izpostavljenost čebel nepesticidom: pregled metod in objavljenih rezultatov. Kmetijstvo. ekosistem. Sreda. 314, 107423 (2021).
Kopit AM, Klinger E, Cox-Foster DL, Ramirez RA in Pitts-Singer TL Vpliv vrste oskrbe in izpostavljenosti pesticidom na razvoj ličink Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Sreda. Ntomore. 51, 240–251 (2022).
Kopit AM in Pitts-Singer TL Poti izpostavljenosti pesticidom pri samotnih čebelah, ki živijo v praznih gnezdih. Sreda. Ntomore. 47, 499–510 (2018).
Pan, NT et al. Nov protokol biološkega testa za ocenjevanje toksičnosti pesticidov pri odraslih japonskih vrtnih čebelah (Osmia cornifrons). The Science. Reports 10, 9517 (2020).
Čas objave: 14. maj 2024