Borova ogorčica je karantenski selitveni endoparazit, za katerega je znano, da povzroča hude gospodarske izgube v ekosistemih borovih gozdov. Ta študija obravnava nematicidno aktivnost halogeniranih indolov proti borovim ogorčicam in njihov mehanizem delovanja. Nematicidne aktivnosti 5-jodoindola in avermektina (pozitivna kontrola) proti borovim ogorčicam so bile podobne in visoke pri nizkih koncentracijah (10 μg/mL). 5-jodoindol je zmanjšal plodnost, reproduktivno aktivnost, umrljivost zarodkov in ličink ter lokomotorno vedenje. Molekularne interakcije ligandov z za nevretenčarje specifičnimi receptorji za kloridne kanale z glutamatom podpirajo idejo, da se 5-jodoindol, tako kot avermektin, tesno veže na aktivno mesto receptorja. 5-jodoindol je povzročil tudi različne fenotipske deformacije pri ogorčicah, vključno z nenormalnim kolapsom/krčenjem organa in povečano vakuolizacijo. Ti rezultati kažejo, da lahko vakuole igrajo vlogo pri smrti, ki jo povzroča metilacija ogorčic. Pomembno je, da 5-jodoindol ni bil strupen za obe rastlinski vrsti (zelje in redkev). Tako ta študija dokazuje, da uporaba jodoindola v okoljskih pogojih lahko nadzoruje poškodbe borovega venenja.
Borova ogorčica (Bursaphelenchus xylophilus) spada med ogorčice borovega lesa (PWN), selitvene endoparazitske ogorčice, za katere je znano, da povzročajo resno ekološko škodo ekosistemom borovega gozda1. Bolezen borovega venenja (PWD), ki jo povzroča ogorčica borovega lesa, postaja resen problem na več celinah, vključno z Azijo in Evropo, v Severni Ameriki pa ogorčica uničuje vnesene vrste borovcev1,2. Propadanje bora je velik gospodarski problem, obeti njegovega globalnega širjenja pa so zaskrbljujoči3. Ogorčice najpogosteje napadajo naslednje vrste bora: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii in Pinus radiata4. Borova ogorčica je resna bolezen, ki lahko ubije borovce v tednih ali mesecih po okužbi. Poleg tega so izbruhi borovih ogorčic pogosti v različnih ekosistemih, zato so bile vzpostavljene obstojne verige okužb1.
Bursaphelenchus xylophilus je karantenska rastlinsko-parazitska ogorčica, ki pripada naddružini Aphelenchoidea in klasu 102.5. Ogorčica se prehranjuje z glivami in se razmnožuje v lesnem tkivu borovcev, pri čemer se razvije v štiri različne ličinke: L1, L2, L3, L4 in odrasel osebek1,6. V pogojih pomanjkanja hrane borova ogorčica preide v specializirano ličinko – dauer, ki parazitira na njenem prenašalcu – borovem podlubniku (Monochamus alternatus) in se prenese na zdravo borovo drevje. Pri zdravih gostiteljih ogorčice hitro migrirajo skozi rastlinska tkiva in se prehranjujejo s parenhimskimi celicami, kar vodi do številnih preobčutljivostnih reakcij, venenja bora in smrti v enem letu po okužbi1,7,8.
Biološko zatiranje borovih ogorčic je že dolgo izziv, saj karantenski ukrepi segajo v 20. stoletje. Trenutne strategije za nadzor borovih ogorčic vključujejo predvsem kemične obdelave, vključno z zaplinjevanjem lesa in implantacijo nematicidov v drevesna debla. Najpogosteje uporabljana nematicida sta avermektin in avermektin benzoat, ki spadata v družino avermektinov. Te drage kemikalije so zelo učinkovite proti številnim vrstam ogorčic in veljajo za okolju varne9. Vendar pa se pričakuje, da bo ponavljajoča se uporaba teh ogorčic ustvarila selekcijski pritisk, ki bo skoraj zagotovo privedel do pojava odpornih borovih ogorčic, kot je bilo dokazano za številne škodljivce, kot so Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ter ogorčice Trichostrongylus colubriformis in Ostertagia circumcincta, ki so postopoma razvile odpornost na avermektini10,11,12. Zato je treba vzorce odpornosti redno preučevati in nematicide nenehno pregledovati, da bi našli alternativne, stroškovno učinkovite in okolju prijazne ukrepe za nadzor PVD. V zadnjih desetletjih je več avtorjev predlagalo uporabo rastlinskih izvlečkov, eteričnih olj in hlapnih snovi kot sredstev za zatiranje nematod13,14,15,16.
Nedavno smo dokazali nematicidno aktivnost indola, medcelične in medkraljevske signalne molekule, pri Caenorhabditis elegans 17 . Indol je razširjen znotrajcelični signal v mikrobni ekologiji, ki nadzoruje številne funkcije, ki vplivajo na mikrobno fiziologijo, tvorbo spor, stabilnost plazmidov, odpornost na zdravila, tvorbo biofilma in virulenco 18, 19. Delovanje indola in njegovih derivatov proti drugim patogenim ogorčicam ni raziskano. V tej študiji smo raziskali nematicidno aktivnost 34 indolov proti borovim ogorčicam in razjasnili mehanizem delovanja najmočnejšega 5-jodoindola z uporabo mikroskopije, fotografiranja s časovnim zamikom in eksperimentov z molekularnim priklopom ter ocenili njegove toksične učinke na rastline s testom kalitve semena.
Prej so poročali, da imajo visoke koncentracije (>1,0 mM) indola nematocidni učinek na ogorčice17. Po zdravljenju B. xylophilus (mešana življenjska obdobja) z indolom ali 33 različnimi derivati indola pri 1 mM je bila smrtnost B. xylophilus izmerjena s štetjem živih in mrtvih ogorčic v kontrolni in tretirani skupini. Pet indolov je pokazalo pomembno nematicidno aktivnost; preživetje nezdravljene kontrolne skupine je bilo po 24 urah 95 ± 7 %. Od 34 testiranih indolov sta 5-jodoindol in 4-fluoroindol pri 1 mM povzročila 100-odstotno smrtnost, medtem ko so 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat in 7-jodoindol povzročili približno 50-odstotno smrtnost (tabela 1).
Vpliv 5-jodoindola na tvorbo vakuol in metabolizem ogorčice borovega lesa. (A) Učinek avermektina in 5-jodoindola na odrasle samce ogorčic, (B) jajčeca ogorčic v stadiju L1 in (C) metabolizem B. xylophilus, (i) vakuole niso opazili ob 0 urah, zdravljenje je povzročilo (ii) vakuole, (iii) kopičenje več vakuol, (iv) otekanje vakuol, (v) zlitje vakuol in (vi) nastanek velikanskih vakuol. Rdeče puščice kažejo nabrekanje vakuol, modre puščice označujejo zlitje vakuol in črne puščice označujejo velikanske vakuole. Lestvica = 50 μm.
Poleg tega je ta študija opisala tudi zaporedni proces z metanom povzročene smrti borovih ogorčic (slika 4C). Metanogena smrt je neapoptotična vrsta celične smrti, povezana s kopičenjem izrazitih citoplazemskih vakuol27. Zdi se, da so morfološke napake, opažene pri borovih ogorčicah, tesno povezane z mehanizmom smrti, ki jo povzroča metan. Mikroskopski pregled ob različnih časih je pokazal, da so po 20 urah izpostavljenosti 5-jodoindolu (0,1 mM) nastale velikanske vakuole. Po 8 urah zdravljenja so opazili mikroskopske vakuole, njihovo število pa se je povečalo po 12 urah. Po 14 urah so opazili več velikih vakuol. Več zlitih vakuol je bilo jasno vidnih po 12–16 urah zdravljenja, kar kaže, da je zlitje vakuol osnova mehanizma metanogene smrti. Po 20 urah je bilo v črvu najdenih več velikanskih vakuol. Ta opažanja predstavljajo prvo poročilo o metuozi pri C. elegans.
Pri črvih, obdelanih s 5-jodoindolom, so opazili tudi agregacijo in rupturo vakuole (slika 5), kar dokazuje upogibanje črva in sproščanje vakuole v okolje. Motnje vakuole so opazili tudi v membrani jajčne lupine, ki jo L2 med izvalitvijo običajno ohrani nedotaknjeno (dopolnilna slika S2). Ta opažanja podpirajo vpletenost kopičenja tekočine in osmoregulacijske odpovedi ter reverzibilne celične poškodbe (RCI) v procesu tvorbe vakuole in supuracije (slika 5).
S hipotezo o vlogi joda pri opaženi tvorbi vakuol smo raziskali nematicidno aktivnost natrijevega jodida (NaI) in kalijevega jodida (KI). Vendar pri koncentracijah (0,1, 0,5 ali 1 mM) niso vplivali niti na preživetje ogorčic niti na tvorbo vakuol (dodatna slika S5), čeprav je imel 1 mM KI rahel nematicidni učinek. Po drugi strani pa je 7-jodoindol (1 ali 2 mM), tako kot 5-jodoindol, povzročil več vakuol in strukturnih deformacij (dopolnilna slika S6). Oba jodoindola sta pokazala podobne fenotipske lastnosti pri borovih ogorčicah, medtem ko NaI in KI nista. Zanimivo je, da indol ni povzročil tvorbe vakuol v B. xylophilus pri testiranih koncentracijah (podatki niso prikazani). Tako so rezultati potrdili, da je kompleks indol-jod odgovoren za vakuolizacijo in metabolizem B. xylophilus.
Med indoli, testiranimi glede nematicidnega delovanja, je imel 5-jodoindol najvišji indeks zdrsa -5,89 kcal/mol, sledili so mu 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) in indol (-4,03) (slika 6). Močna ogrodna vodikova vez 5-jodoindola na levcin 218 stabilizira njegovo vezavo, medtem ko se vsi drugi derivati indola vežejo na serin 260 preko vodikovih vezi stranske verige. Med drugimi modeliranimi jodoindoli ima 2-jodoindol vrednost vezave -5,248 kcal/mol, kar je posledica njegove glavne vodikove vezi z levcinom 218. Druge znane vezave vključujejo 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) in 6-fluoroindol (-2,6). kcal/mol) (dodatna slika S8). Večina halogeniranih indolov in indol sam, z izjemo 5-jodoindola in 2-jodoindola, tvori vez s serinom 260. Dejstvo, da vodikova vez z levcinom 218 kaže na učinkovito vezavo na receptor-ligand, kot je opaženo za ivermektin (dodatna slika S7), potrjuje, da 5-jodoindol in 2-jodoindol se, tako kot ivermektin, tesno veže na aktivno mesto receptorja GluCL prek levcina 218 (slika 6 in dopolnilna slika S8). Predlagamo, da je ta vezava potrebna za vzdrževanje strukture odprtih por kompleksa GluCL in da s tesno vezavo na aktivno mesto receptorja GluCL 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermektin in ivermektin tako ohranjajo ionski kanal odprt in omogočajo vnos tekočine.
Molekularno spajanje indola in halogeniranega indola z GluCL. Usmeritve vezave ligandov (A) indola, (B) 4-fluoroindola, (C) 7-jodoindola in (D) 5-jodoindola na aktivno mesto GluCL. Protein je predstavljen s trakom, hrbtenične vodikove vezi pa so prikazane kot rumene pikčaste črte. (A'), (B'), (C') in (D') prikazujejo interakcije ustreznih ligandov z okoliškimi aminokislinskimi ostanki, vodikove vezi stranske verige pa so označene z rožnatimi pikčastimi puščicami.
Izvedeni so bili poskusi za oceno toksičnega učinka 5-jodoindola na kalitev semen zelja in redkvice. 5-jodoindol (0,05 ali 0,1 mM) ali avermektin (10 μg/mL) sta imela majhen ali nič vpliva na začetno kalitev in vznik rastlin (slika 7). Poleg tega ni bilo ugotovljene pomembne razlike med stopnjo kalitve netretiranih kontrol in semen, tretiranih s 5-jodoindolom ali avermektinom. Učinek na raztezek glavnega korena in število tvorjenih stranskih korenin je bil nepomemben, čeprav je 1 mM (10-kratnik aktivne koncentracije) 5-jodoindola nekoliko upočasnil razvoj stranskih korenin. Ti rezultati kažejo, da je 5-jodoindol netoksičen za rastlinske celice in ne moti razvojnih procesov rastlin pri proučevanih koncentracijah.
Vpliv 5-jodoindola na kalitev semen. Kaljenje, kaljenje in stransko ukoreninjenje semen B. oleracea in R. raphanistrum na agarskem gojišču Murashige in Skoog z ali brez avermektina ali 5-jodoindola. Kalitev smo zabeležili po 3 dneh inkubacije pri 22 °C.
Ta študija poroča o več primerih ubijanja ogorčic z indoli. Pomembno je, da je to prvo poročilo o metilaciji, ki povzroča jodoindol (proces, ki ga povzroči kopičenje majhnih vakuol, ki se postopoma združijo v velikanske vakuole, sčasoma vodijo do razpoka membrane in smrti) v borovih iglicah, pri čemer ima jodoindol pomembne nematicidne lastnosti, podobne tistim komercialnega nematicida avermektina.
Prej so poročali, da indoli izvajajo več signalnih funkcij pri prokariontih in evkariontih, vključno z inhibicijo/tvorbo biofilma, preživetjem bakterij in patogenostjo 19, 32, 33, 34. V zadnjem času so potencialni terapevtski učinki halogeniranih indolov, indolnih alkaloidov in polsintetičnih derivatov indola pritegnili obsežno raziskovalno zanimanje35,36,37. Na primer, dokazano je, da halogenirani indoli ubijajo obstojne celice Escherichia coli in Staphylococcus aureus37. Poleg tega je znanstveno zanimivo preučevanje učinkovitosti halogeniranih indolov proti drugim vrstam, rodovom in kraljestvom, ta študija pa je korak k doseganju tega cilja.
Tukaj predlagamo mehanizem za smrtnost, povzročeno s 5-jodoindolom pri C. elegans, ki temelji na reverzibilni celični poškodbi (RCI) in metilaciji (sliki 4C in 5). Edematozne spremembe, kot sta zabuhlost in vakuolna degeneracija, so indikatorji RCI in metilacije, ki se kažejo kot velikanske vakuole v citoplazmi 48, 49. RCI moti proizvodnjo energije z zmanjšanjem proizvodnje ATP, povzroča odpoved ATPazne črpalke ali moti celične membrane in povzroča hiter dotok Na+, Ca2+ in vode50,51,52. Intracitoplazmatske vakuole nastanejo v živalskih celicah kot posledica kopičenja tekočine v citoplazmi zaradi dotoka Ca2+ in vode53. Zanimivo je, da je ta mehanizem celične poškodbe reverzibilen, če je poškodba začasna in celice začnejo proizvajati ATP za določeno časovno obdobje, če pa poškodba traja ali se poslabša, celice umrejo.54 Naša opažanja kažejo, da ogorčice, zdravljene s 5-jodoindolom, po izpostavljenosti stresnim razmeram ne morejo obnoviti normalne biosinteze.
Fenotip metilacije, ki ga inducira 5-jodoindol v B. xylophilus, je lahko posledica prisotnosti joda in njegove molekularne porazdelitve, saj je imel 7-jodoindol manjši zaviralni učinek na B. xylophilus kot 5-jodoindol (tabela 1 in dodatna slika S6). Ti rezultati so delno skladni s študijami Maltese et al. (2014), ki je poročal, da je translokacija piridilnega dušikovega dela v indolu iz para- v meta-položaj odpravila vakuolizacijo, inhibicijo rasti in citotoksičnost v celicah U251, kar kaže, da je interakcija molekule s specifičnim aktivnim mestom v proteinu kritična27,44,45. Interakcije med indolom ali halogeniranimi indoli in receptorji GluCL, opažene v tej študiji, prav tako podpirajo to idejo, saj je bilo ugotovljeno, da se 5- in 2-jodoindol vežeta na receptorje GluCL močneje kot drugi pregledani indoli (slika 6 in dodatna slika S8). Ugotovljeno je bilo, da se jod na drugem ali petem mestu indola veže na levcin 218 receptorja GluCL preko vodikovih vezi v hrbtenici, medtem ko drugi halogenirani indoli in sam indol tvorijo šibke stranske verige vodikovih vezi s serinom 260 (slika 6). Zato špekuliramo, da ima lokalizacija halogena pomembno vlogo pri indukciji vakuolarne degeneracije, medtem ko tesna vezava 5-jodoindola ohranja ionski kanal odprt, s čimer omogoča hiter dotok tekočine in rupturo vakuole. Vendar je treba podrobnejši mehanizem delovanja 5-jodoindola še določiti.
Pred praktično uporabo 5-jodoindola je treba analizirati njegov toksični učinek na rastline. Naši poskusi kalitve semen so pokazali, da 5-jodoindol pri proučevanih koncentracijah ni imel negativnega učinka na kalitev semen ali kasnejše razvojne procese (slika 7). Tako ta študija predstavlja osnovo za uporabo 5-jodoindola v ekološkem okolju za nadzor škodljivosti borovih ogorčic za borovce.
Prejšnja poročila so pokazala, da terapija na osnovi indola predstavlja potencialni pristop k reševanju problema odpornosti na antibiotike in napredovanja raka55. Poleg tega imajo indoli antibakterijsko, protirakavo, antioksidativno, protivnetno, antidiabetično, protivirusno, antiproliferativno in protituberkulozno delovanje ter lahko služijo kot obetavna osnova za razvoj zdravil56,57. Ta študija prvič nakazuje potencialno uporabo joda kot antiparazitskega in antihelmintičnega sredstva.
Avermektin je bil odkrit pred tremi desetletji in leta 2015 prejel Nobelovo nagrado, njegova uporaba kot antihelmintik pa še vedno aktivno poteka. Vendar pa je zaradi hitrega razvoja odpornosti na avermektine pri ogorčicah in škodljivcih žuželk potrebna alternativna, poceni in okolju prijazna strategija za nadzor okužbe z borovo ogorčico v borovcih. Ta študija poroča tudi o mehanizmu, s katerim 5-jodoindol ubija borove ogorčice in da ima 5-jodoindol nizko toksičnost za rastlinske celice, kar odpira dobre možnosti za njegovo prihodnjo komercialno uporabo.
Vse poskuse je odobril odbor za etiko univerze Yeungnam, Gyeongsan, Koreja, metode pa so bile izvedene v skladu s smernicami odbora za etiko univerze Yeungnam.
Poskusi inkubacije jajc so bili izvedeni po uveljavljenih postopkih43. Za oceno stopnje izvalitve (HR) smo 1 dan stare odrasle ogorčice (približno 100 samic in 100 samcev) prenesli v petrijevke, ki vsebujejo glivo, in jih pustili rasti 24 ur. Jajca smo nato izolirali in obdelali s 5-jodoindolom (0,05 mM in 0,1 mM) ali avermektinom (10 μg/ml) kot suspenzijo v sterilni destilirani vodi. Te suspenzije (500 μl; približno 100 jajc) smo prenesli v vdolbinice plošče s 24 vdolbinicami za tkivne kulture in inkubirali pri 22 °C. Štetje L2 je bilo opravljeno po 24 urah inkubacije, vendar so veljali za mrtve, če se celice niso premaknile, ko so bile stimulirane s fino platinasto žico. Ta poskus je bil izveden v dveh fazah, vsaka s šestimi ponovitvami. Podatke iz obeh poskusov smo združili in predstavili. Odstotek HR se izračuna na naslednji način:
Smrtnost ličink je bila ocenjena s predhodno razvitimi postopki. Jajčeca ogorčic so bila zbrana in zarodki so bili sinhronizirani z izvalitvijo v sterilni destilirani vodi, da so nastale ličinke stopnje L2. Sinhronizirane ličinke (približno 500 ogorčic) smo obdelali s 5-jodoindolom (0,05 mM in 0,1 mM) ali avermektinom (10 μg/ml) in jih gojili na ploščah B. cinerea Petri. Po 48 urah inkubacije pri 22 °C smo ogorčice zbrali v sterilno destilirano vodo in pregledali na prisotnost stopenj L2, L3 in L4. Prisotnost stopenj L3 in L4 je kazala na transformacijo ličink, medtem ko prisotnost stopnje L2 ni kazala na transformacijo. Slike so bile pridobljene s sistemom iRiS™ Digital Cell Imaging System. Ta poskus je bil izveden v dveh fazah, vsaka s šestimi ponovitvami. Podatke iz obeh poskusov smo združili in predstavili.
Toksičnost 5-jodoindola in avermektina za semena je bila ocenjena s testi kalivosti na ploščah z agarjem Murashige in Skoog.62 Semena B. oleracea in R. raphanistrum so bila najprej za en dan namočena v sterilno destilirano vodo, sprana z 1 ml 100 % etanola, sterilizirana z 1 ml 50 % komercialnega belila (3 % natrijev hipoklorit) 15 minut in petkrat izperemo z 1 ml sterilne vode. Sterilizirana semena so bila nato stisnjena na plošče s kalilnim agarjem, ki je vsebovala 0,86 g/l (0,2X) medija Murashige in Skoog ter 0,7 % bakteriološki agar z ali brez 5-jodoindola ali avermektina. Plošče smo nato inkubirali pri 22 °C in slike posneli po 3 dneh inkubacije. Ta poskus je bil izveden v dveh fazah, od katerih je imela vsaka šest ponovitev.
Čas objave: 26. februarja 2025