Borova ogorčica je karantenski selivski endoparazit, za katerega je znano, da povzroča velike gospodarske izgube v ekosistemih borovih gozdov. Ta študija pregleduje nematocidno aktivnost halogeniranih indolov proti borovim ogorčicam in njihov mehanizem delovanja. Nematocidna aktivnost 5-jodoindola in avermektina (pozitivna kontrola) proti borovim ogorčicam je bila podobna in visoka pri nizkih koncentracijah (10 μg/mL). 5-jodoindol je zmanjšal plodnost, reproduktivno aktivnost, embrionalno in ličinkarsko umrljivost ter lokomotorno vedenje. Molekularne interakcije ligandov z nevretenčarskimi specifičnimi receptorji glutamatnih kloridnih kanalov podpirajo idejo, da se 5-jodoindol, tako kot avermektin, tesno veže na aktivno mesto receptorja. 5-jodoindol je povzročil tudi različne fenotipske deformacije pri ogorčicah, vključno z nenormalnim kolapsom/krčenjem organov in povečano vakuolizacijo. Ti rezultati kažejo, da lahko vakuole igrajo vlogo pri smrti, ki jo povzroča metilacija ogorčic. Pomembno je, da 5-jodoindol ni bil strupen za obe rastlinski vrsti (zelje in redkev). Ta študija torej dokazuje, da lahko uporaba jodoindola v okoljskih pogojih nadzoruje poškodbe zaradi venenja bora.
Borova ogorčica (Bursaphelenchus xylophilus) spada med borove ogorčice (PWN), selitvene endoparazitske ogorčice, za katere je znano, da povzročajo hudo ekološko škodo ekosistemom borovih gozdov1. Bolezen borovega venenja (PWD), ki jo povzroča borova ogorčica, postaja resen problem na več celinah, vključno z Azijo in Evropo, v Severni Ameriki pa ogorčica uničuje vnesene vrste borov1,2. Propadanje borovcev je velik gospodarski problem, možnost njenega globalnega širjenja pa je zaskrbljujoča3. Ogorčica najpogosteje napada naslednje vrste borov: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii in Pinus radiata4. Borova ogorčica je resna bolezen, ki lahko uniči borovce v nekaj tednih ali mesecih po okužbi. Poleg tega so izbruhi borovih ogorčic pogosti v različnih ekosistemih, zato so se vzpostavile vztrajne okužbene verige1.
Bursaphelenchus xylophilus je karantenska rastlinska parazitska ogorčica, ki spada v naddružino Aphelenchoidea in klad 102.5. Ogorčica se prehranjuje z glivami in se razmnožuje v lesnih tkivih borovcev, kjer se razvije v štiri različne larvalne stopnje: L1, L2, L3, L4 in odraslo osebo1,6. V pogojih pomanjkanja hrane borova ogorčica preide v specializirano larvalno stopnjo – dauer, ki parazitira na svojem prenašalcu – borovem lubadarju (Monochamus alternatus) in se prenese na zdrave borovce. V zdravih gostiteljih ogorčice hitro migrirajo skozi rastlinska tkiva in se hranijo s parenhimskimi celicami, kar vodi do številnih preobčutljivostnih reakcij, venenja bora in smrti v enem letu po okužbi1,7,8.
Biološki nadzor nad borovimi ogorčicami je že dolgo izziv, saj karantenski ukrepi segajo v 20. stoletje. Trenutne strategije za nadzor nad borovimi ogorčicami vključujejo predvsem kemične obdelave, vključno z zaplinjevanjem lesa in vsaditvijo nematicidov v drevesna debla. Najpogosteje uporabljena nematicida sta avermektin in avermektin benzoat, ki spadata v družino avermektinov. Ti dragi kemikaliji sta zelo učinkoviti proti številnim vrstam ogorčic in veljata za okolju varna9. Vendar pa se pričakuje, da bo ponavljajoča selekcijska uporaba teh nematicidov ustvarila selekcijski pritisk, ki bo skoraj zagotovo privedel do pojava odpornih borovih ogorčic, kot je bilo dokazano pri več škodljivcih žuželk, kot so Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ter ogorčice Trichostrongylus colubriformis in Ostertagia circumcincta, ki so postopoma razvile odpornost na avermektine10,11,12. Zato je treba redno preučevati vzorce odpornosti in nematicide nenehno pregledovati, da bi našli alternativne, stroškovno učinkovite in okolju prijazne ukrepe za nadzor PVD. V zadnjih desetletjih je več avtorjev predlagalo uporabo rastlinskih izvlečkov, eteričnih olj in hlapnih snovi kot sredstev za zatiranje ogorčic13,14,15,16.
Nedavno smo pri Caenorhabditis elegans pokazali nematicidno aktivnost indola, medcelične in medkraljevske signalne molekule. Indol je široko razširjen znotrajcelični signal v mikrobni ekologiji, ki nadzoruje številne funkcije, ki vplivajo na mikrobno fiziologijo, tvorbo spor, stabilnost plazmidov, odpornost na zdravila, tvorbo biofilma in virulenco 18, 19. Aktivnost indola in njegovih derivatov proti drugim patogenim ogorčicam še ni bila proučevana. V tej študiji smo raziskali nematicidno aktivnost 34 indolov proti borovim ogorčicam in pojasnili mehanizem delovanja najmočnejšega 5-jodoindola z uporabo mikroskopije, časovno zakasnitvene fotografije in molekularnega sidranja ter ocenili njegove toksične učinke na rastline z uporabo testa kalivosti semen.
Visoke koncentracije (> 1,0 mM) indola so že prej poročale o nematocidnem učinku na ogorčice17. Po tretiranju B. xylophilus (mešane življenjske faze) z indolom ali 33 različnimi derivati indola pri 1 mM je bila smrtnost B. xylophilus izmerjena s štetjem živih in mrtvih ogorčic v kontrolni in tretirani skupini. Pet indolov je pokazalo pomembno nematocidno aktivnost; preživetje netretirane kontrolne skupine je bilo po 24 urah 95 ± 7 %. Od 34 testiranih indolov sta 5-jodoindol in 4-fluoroindol pri 1 mM povzročila 100-odstotno smrtnost, medtem ko so 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat in 7-jodoindol povzročili približno 50-odstotno smrtnost (tabela 1).
Vpliv 5-jodoindola na nastanek vakuol in presnovo borove ogorčice. (A) Vpliv avermektina in 5-jodoindola na odrasle samce ogorčic, (B) jajčeca ogorčic v stadiju L1 in (C) presnova B. xylophilus, (i) vakuole niso bile opažene pri 0 urah, obdelava je povzročila (ii) vakuole, (iii) kopičenje več vakuol, (iv) otekanje vakuol, (v) zlitje vakuol in (vi) nastanek velikanskih vakuol. Rdeče puščice označujejo otekanje vakuol, modre puščice označujejo zlitje vakuol, črne puščice pa označujejo velikanske vakuole. Merilo = 50 μm.
Poleg tega je ta študija opisala tudi zaporedni proces metano povzročene smrti pri borovih ogorčicah (slika 4C). Metanogena smrt je neapoptotična vrsta celične smrti, povezana s kopičenjem izrazitih citoplazemskih vakuol27. Zdi se, da so morfološke napake, opažene pri borovih ogorčicah, tesno povezane z mehanizmom metano povzročene smrti. Mikroskopski pregled v različnih časih je pokazal, da so se po 20 urah izpostavljenosti 5-jodoindolu (0,1 mM) oblikovale ogromne vakuole. Mikroskopske vakuole so opazili po 8 urah obdelave, njihovo število pa se je povečalo po 12 urah. Po 14 urah so opazili več velikih vakuol. Po 12–16 urah obdelave je bilo jasno vidnih več spojenih vakuol, kar kaže, da je fuzija vakuol osnova mehanizma metanogene smrti. Po 20 urah so po celotnem črvu našli več velikanskih vakuol. Ta opažanja predstavljajo prvo poročilo o metuozi pri C. elegans.
Pri črvih, zdravljenih s 5-jodoindolom, so opazili tudi agregacijo in rupturo vakuol (slika 5), kar je bilo razvidno iz upogibanja črva in sproščanja vakuol v okolje. Razpad vakuol so opazili tudi v membrani jajčne lupine, ki jo L2 med valjenjem običajno ohrani nedotaknjeno (dodatna slika S2). Ta opažanja podpirajo vpletenost kopičenja tekočine in osmoregulacijske odpovedi ter reverzibilne poškodbe celic (RCI) v proces nastajanja in gnojenja vakuol (slika 5).
S hipotezo o vlogi joda pri opaženem nastanku vakuol smo raziskali nematicidno aktivnost natrijevega jodida (NaI) in kalijevega jodida (KI). Vendar pa pri koncentracijah (0,1, 0,5 ali 1 mM) nista vplivala niti na preživetje ogorčic niti na nastanek vakuol (dodatna slika S5), čeprav je imel 1 mM KI rahel nematicidni učinek. Po drugi strani pa je 7-jodoindol (1 ali 2 mM), tako kot 5-jodoindol, povzročil več vakuol in strukturne deformacije (dodatna slika S6). Jodoindola sta pokazala podobne fenotipske značilnosti pri borovih ogorčicah, medtem ko NaI in KI nista. Zanimivo je, da indol pri testiranih koncentracijah ni povzročil nastanka vakuol pri B. xylophilus (podatki niso prikazani). Rezultati so tako potrdili, da je kompleks indol-jod odgovoren za vakuolizacijo in presnovo B. xylophilus.
Med indoli, testiranimi na nematicidno aktivnost, je imel 5-jodoindol najvišji indeks zdrsa -5,89 kcal/mol, sledili so mu 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) in indol (-4,03) (slika 6). Močna vodikova vez 5-jodoindola z levcinom 218 stabilizira njegovo vezavo, medtem ko se vsi drugi derivati indola vežejo na serin 260 preko vodikovih vezi stranske verige. Med drugimi modeliranimi jodoindoli ima 2-jodoindol vezavno vrednost -5,248 kcal/mol, kar je posledica njegove glavne vodikove vezi z levcinom 218. Druge znane vezave vključujejo 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) in 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (dodatna slika S8). Večina halogeniranih indolov in sam indol, z izjemo 5-jodoindola in 2-jodoindola, tvorijo vez s serinom 260. Dejstvo, da vodikova vez z levcinom 218 kaže na učinkovito vezavo receptor-ligand, kot je bilo opaženo pri ivermektinu (dodatna slika S7), potrjuje, da se 5-jodoindol in 2-jodoindol, tako kot ivermektin, tesno vežeta na aktivno mesto receptorja GluCL preko levcina 218 (slika 6 in dodatna slika S8). Predlagamo, da je ta vezava potrebna za ohranjanje odprte strukture por kompleksa GluCL in da s tesno vezavo na aktivno mesto receptorja GluCL 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermektin in ivermektin tako ohranjajo ionski kanal odprt in omogočajo absorpcijo tekočine.
Molekularno vezanje indola in halogeniranega indola na GluCL. Vezavne orientacije ligandov (A) indola, (B) 4-fluoroindola, (C) 7-jodoindola in (D) 5-jodoindola na aktivno mesto GluCL. Protein je predstavljen s trakom, vodikove vezi v hrbtenici pa so prikazane kot rumene pikčaste črte. (A′), (B′), (C′) in (D′) prikazujejo interakcije ustreznih ligandov z okoliškimi aminokislinskimi ostanki, vodikove vezi v stranskih verigah pa so označene z rožnatimi pikčastimi puščicami.
Izvedeni so bili poskusi za oceno toksičnega učinka 5-jodoindola na kalitev semen zelja in redkvice. 5-jodoindol (0,05 ali 0,1 mM) ali avermektin (10 μg/ml) je imel le majhen ali nobenega vpliva na začetno kalitev in vznik rastlin (slika 7). Poleg tega ni bilo ugotovljene pomembne razlike med stopnjo kalivosti netretiranih kontrolnih semen in semen, tretiranih s 5-jodoindolom ali avermektinom. Vpliv na podaljševanje glavne korenine in število nastalih stranskih korenin je bil neznaten, čeprav je 1 mM (10-kratnik njegove aktivne koncentracije) 5-jodoindola nekoliko upočasnil razvoj stranskih korenin. Ti rezultati kažejo, da 5-jodoindol ni toksičen za rastlinske celice in pri preučevanih koncentracijah ne moti procesov razvoja rastlin.
Vpliv 5-jodoindola na kalitev semen. Kalitev, kaljenje in lateralno ukoreninjenje semen B. oleracea in R. raphanistrum na agarskem gojišču Murashige in Skoog z ali brez avermektina ali 5-jodoindola. Kalitev je bila zabeležena po 3 dneh inkubacije pri 22 °C.
Ta študija poroča o več primerih uničenja ogorčic z indoli. Pomembno je, da je to prvo poročilo o tem, da jodoindol povzroča metilacijo (proces, ki ga povzroči kopičenje majhnih vakuol, ki se postopoma združijo v ogromne vakuole, kar sčasoma vodi do razpoke membrane in smrti) v borovih iglicah, pri čemer jodoindol kaže pomembne nematicidne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima komercialni nematicid avermektin.
Predhodno je bilo poročano, da indoli izvajajo več signalnih funkcij pri prokariontih in evkariontih, vključno z inhibicijo/nastankom biofilma, preživetjem bakterij in patogenostjo19,32,33,34. Nedavno so potencialni terapevtski učinki halogeniranih indolov, indolnih alkaloidov in polsintetičnih indolnih derivatov pritegnili veliko raziskovalnega zanimanja35,36,37. Na primer, dokazano je, da halogenirani indoli uničujejo persistentne celice Escherichia coli in Staphylococcus aureus37. Poleg tega je znanstveno zanimivo preučiti učinkovitost halogeniranih indolov proti drugim vrstam, rodovom in kraljestvom, ta študija pa je korak k dosegi tega cilja.
Tukaj predlagamo mehanizem za smrtnost, ki jo pri C. elegans povzroča 5-jodoindol, ki temelji na reverzibilni poškodbi celic (RCI) in metilaciji (sliki 4C in 5). Edematozne spremembe, kot sta otekanje in vakuolarna degeneracija, so kazalniki RCI in metilacije, ki se kažejo kot ogromne vakuole v citoplazmi48,49. RCI moti proizvodnjo energije z zmanjšanjem proizvodnje ATP, kar povzroči odpoved ATPazne črpalke ali pa poruši celične membrane in povzroči hiter dotok Na+, Ca2+ in vode50,51,52. Intracitoplazmatske vakuole nastanejo v živalskih celicah kot posledica kopičenja tekočine v citoplazmi zaradi dotoka Ca2+ in vode53. Zanimivo je, da je ta mehanizem poškodbe celic reverzibilen, če je poškodba začasna in celice začnejo proizvajati ATP določeno časovno obdobje, če pa poškodba traja ali se poslabša, celice umrejo.54 Naša opažanja kažejo, da ogorčice, zdravljene s 5-jodoindolom, po izpostavljenosti stresnim pogojem ne morejo obnoviti normalne biosinteze.
Metilacijski fenotip, ki ga pri B. xylophilus povzroča 5-jodoindol, je lahko posledica prisotnosti joda in njegove molekularne porazdelitve, saj je imel 7-jodoindol manjši zaviralni učinek na B. xylophilus kot 5-jodoindol (tabela 1 in dodatna slika S6). Ti rezultati so delno skladni s študijami Malteseja in sodelavcev (2014), ki so poročali, da je translokacija piridilnega dušikovega dela v indolu iz para- v meta-položaj odpravila vakuolizacijo, zaviranje rasti in citotoksičnost v celicah U251, kar kaže na to, da je interakcija molekule s specifičnim aktivnim mestom v proteinu ključnega pomena27,44,45. Interakcije med indolom ali halogeniranimi indoli in receptorji GluCL, opažene v tej študiji, prav tako podpirajo to idejo, saj se je izkazalo, da se 5- in 2-jodoindol močneje vežeta na receptorje GluCL kot drugi pregledani indoli (slika 6 in dodatna slika S8). Ugotovljeno je bilo, da se jod na drugem ali petem položaju indola veže na levcin 218 receptorja GluCL preko vodikovih vezi v hrbtenični verigi, medtem ko drugi halogenirani indoli in sam indol tvorijo šibke vodikove vezi stranske verige s serinom 260 (slika 6). Zato domnevamo, da ima lokalizacija halogena pomembno vlogo pri indukciji vakuolarne degeneracije, medtem ko tesna vezava 5-jodoindola ohranja ionski kanal odprt, kar omogoča hiter dotok tekočine in rupturo vakuole. Vendar pa podroben mehanizem delovanja 5-jodoindola še ni določen.
Pred praktično uporabo 5-jodoindola je treba analizirati njegov toksični učinek na rastline. Naši poskusi kalitve semen so pokazali, da 5-jodoindol pri preučevanih koncentracijah ni imel negativnega vpliva na kalitev semen ali nadaljnje razvojne procese (slika 7). Ta študija tako zagotavlja osnovo za uporabo 5-jodoindola v ekološkem okolju za nadzor škodljivosti borovih ogorčic za borovce.
Prejšnja poročila so pokazala, da terapija na osnovi indola predstavlja potencialni pristop k reševanju problema odpornosti na antibiotike in napredovanja raka55. Poleg tega imajo indoli antibakterijsko, protirakavo, antioksidativno, protivnetno, antidiabetično, protivirusno, antiproliferativno in protituberkulozno delovanje ter lahko služijo kot obetavna osnova za razvoj zdravil56,57. Ta študija prvič nakazuje potencialno uporabo joda kot antiparazitskega in antihelmintičnega sredstva.
Avermektin so odkrili pred tremi desetletji in leta 2015 prejeli Nobelovo nagrado, njegova uporaba kot antihelmintika pa še vedno aktivno poteka. Vendar pa je zaradi hitrega razvoja odpornosti na avermektine pri ogorčicah in škodljivcih potrebna alternativna, cenovno ugodna in okolju prijazna strategija za nadzor okužbe z borovo borovo strupo. Ta študija poroča tudi o mehanizmu, s katerim 5-jodoindol ubija borove ogorčice, in o tem, da ima 5-jodoindol nizko toksičnost za rastlinske celice, kar odpira dobre možnosti za njegovo prihodnjo komercialno uporabo.
Vse poskuse je odobril Etični odbor Univerze Yeungnam v Gyeongsanu v Koreji, metode pa so bile izvedene v skladu s smernicami Etičnega odbora Univerze Yeungnam.
Poskusi inkubacije jajčec so bili izvedeni po ustaljenih postopkih43. Za oceno stopnje izvalitve (HR) so bile 1 dan stare odrasle ogorčice (približno 100 samic in 100 samcev) prenesene v petrijevke z glivo in puščene rasti 24 ur. Jajčeca so bila nato izolirana in obdelana s 5-jodoindolom (0,05 mM in 0,1 mM) ali avermektinom (10 μg/ml) kot suspenzija v sterilni destilirani vodi. Te suspenzije (500 μl; približno 100 jajčec) so bile prenesene v vdolbinice 24-vdolbične plošče za tkivne kulture in inkubirane pri 22 °C. Štetje L2 je bilo opravljeno po 24 urah inkubacije, vendar so bile štete za mrtve, če se celice niso premaknile, ko so bile stimulirane s tanko platinasto žico. Ta poskus je bil izveden v dveh fazah, vsaka s šestimi ponovitvami. Podatki iz obeh poskusov so bili združeni in predstavljeni. Odstotek HR se izračuna na naslednji način:
Smrtnost ličink je bila ocenjena z uporabo predhodno razvitih postopkov. Jajčeca ogorčic so bila zbrana, zarodki pa sinhronizirani z izvalitvijo v sterilni destilirani vodi, da so nastale ličinke v stadiju L2. Sinhronizirane ličinke (približno 500 ogorčic) so bile obdelane s 5-jodoindolom (0,05 mM in 0,1 mM) ali avermektinom (10 μg/ml) in vzrejene na Petrijevih ploščah B. cinerea. Po 48 urah inkubacije pri 22 °C so bile ogorčice zbrane v sterilni destilirani vodi in pregledane na prisotnost stadijev L2, L3 in L4. Prisotnost stadijev L3 in L4 je kazala na larvalno transformacijo, medtem ko prisotnost stadija L2 ni kazala na transformacijo. Slike so bile pridobljene z uporabo sistema za digitalno slikanje celic iRiS™. Ta poskus je bil izveden v dveh fazah, vsaka s šestimi ponovitvami. Podatki iz obeh poskusov so bili združeni in predstavljeni.
Toksičnost 5-jodoindola in avermektina za semena je bila ocenjena z uporabo testov kalivosti na ploščah z agarjem Murashige in Skoog.62 Semena B. oleracea in R. raphanistrum so bila najprej en dan namočena v sterilni destilirani vodi, oprana z 1 ml 100 % etanola, 15 minut sterilizirana z 1 ml 50 % komercialnega belila (3 % natrijev hipoklorit) in petkrat oprana z 1 ml sterilne vode. Sterilizirana semena so bila nato pritisnjena na plošče z agarjem za kalitev, ki so vsebovale 0,86 g/l (0,2X) gojišča Murashige in Skoog ter 0,7 % bakteriološkega agarja z ali brez 5-jodoindola ali avermektina. Plošče so bile nato inkubirane pri 22 °C, slike pa so bile posnete po 3 dneh inkubacije. Ta poskus je bil izveden v dveh fazah, vsaka s šestimi ponovitvami.
Čas objave: 26. februar 2025