Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljše rezultate priporočamo, da uporabite novejšo različico brskalnika (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikazujemo brez oblikovanja ali JavaScripta.
Odkritje in koristna uporaba naravnih proizvodov lahko pomaga izboljšati človeško življenje.Kemikalije za zaviranje rasti rastlin se pogosto uporabljajo kot herbicidi za zatiranje plevela.Zaradi potrebe po uporabi različnih vrst herbicidov je treba identificirati spojine z novimi mehanizmi delovanja.V tej študiji smo odkrili novo spojino N-alkoksipirola, kumamonamid, iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 in vzpostavili celoten postopek sinteze.S testi biološke aktivnosti smo odkrili, da je urs-monoaminska kislina sintetični intermediat urs-monoamida in potencialnozaviralec rasti rastlin.Poleg tega smo razvili različne derivate urbenonske kisline, vključno z derivatom urbeniloksi (UDA), ki ima visoko herbicidno aktivnost, ne da bi negativno vplival na rast celic HeLa.Ugotovili smo tudi, da derivati urmotonične kisline motijo rastlinske mikrotubule;poleg tega KAND vpliva na aktinske filamente in inducira celično smrt;Ti večplastni učinki se razlikujejo od učinkov znanih zaviralcev mikrotubulov in kažejo na nov mehanizem delovanja ursonske kisline, kar predstavlja pomembno prednost pri razvoju novih herbicidov.
Odkritje in praktična uporaba koristnih naravnih proizvodov in njihovih derivatov je sredstvo za izboljšanje kakovosti človeškega življenja.Sekundarni metaboliti, ki jih proizvajajo mikroorganizmi, rastline in žuželke, so privedli do velikega napredka v medicini in kmetijstvu.Številni antibiotiki in zdravila proti levkemiji so bili razviti iz naravnih proizvodov.Poleg tega različne vrstepesticidi, fungicidi in herbicidi se pridobivajo iz teh naravnih proizvodov za uporabo v kmetijstvu.Zlasti herbicidi za zatiranje plevela so pomembna orodja za povečanje pridelka v sodobnem kmetijstvu, različne vrste spojin pa se že uporabljajo komercialno.Številni celični procesi v rastlinah, kot so fotosinteza, metabolizem aminokislin, sinteza celične stene, regulacija mitoze, signalizacija fitohormonov ali sinteza beljakovin, veljajo za tipične tarče herbicidov.Spojine, ki zavirajo delovanje mikrotubulov, so običajen razred herbicidov, ki vplivajo na rast rastlin tako, da vplivajo na mitotično regulacijo2.
Mikrotubuli so sestavni deli citoskeleta in so v veliki meri ohranjeni v evkariontskih celicah.Heterodimer tubulina je sestavljen iz α-tubulina in β-tubulina, ki tvorita linearne mikrotubulne protofilamente, s 13 protofilamenti, ki tvorijo cilindrično strukturo.Mikrotubuli imajo več vlog v rastlinskih celicah, vključno z določanjem oblike celice, delitvijo celic in znotrajceličnim transportom3,4.Rastlinske celice vsebujejo mikrotubule pod interfazno plazemsko membrano in ti tako imenovani kortikalni mikrotubuli naj bi nadzorovali organizacijo celuloznih mikrofibril z regulacijo kompleksov celulozne sintaze 4,5.Kortikalni mikrotubuli koreninskih epidermalnih celic, ki so prisotni v območju hitrega raztezanja koreninskega vršička, se nahajajo lateralno, celulozna mikrovlakna pa sledijo tem mikrotubulom in omejujejo smer celične ekspanzije ter tako spodbujajo anizotropno celično raztezanje.Zato je funkcija mikrotubulov tesno povezana z morfologijo rastline.Aminokislinske substitucije v genih, ki kodirajo tubulin, povzročajo izkrivljenost nizov kortikalnih mikrotubulov in levo ali desno stransko rast pri Arabidopsis 6,7.Podobno lahko mutacije v proteinih, povezanih z mikrotubulami, ki uravnavajo dinamiko mikrotubulov, vodijo tudi do izkrivljene rasti korenin8,9,10,11,12,13.Poleg tega zdravljenje s herbicidi, ki motijo mikrotubule, kot je dizopiramid, znan tudi kot pretilaklor, povzroči tudi levostransko poševno rast korenin14.Ti podatki kažejo, da je natančna regulacija delovanja mikrotubul ključna za določanje smeri rasti rastlin.
Odkrili so različne vrste zaviralcev mikrotubulov in ta zdravila so pomembno prispevala k raziskavam citoskeleta, pa tudi k kmetijstvu in medicini2.Zlasti orizalin, dinitroanilinske spojine, dizopiramid, benzamidu sorodne spojine in njihovi analogi lahko zavirajo delovanje mikrotubulov in s tem zavirajo rast rastlin.Zato se pogosto uporabljajo kot herbicidi.Ker pa so mikrotubuli pomembna sestavina rastlinskih in živalskih celic, je večina zaviralcev mikrotubulov citotoksičnih za oba tipa celic.Zato se kljub njihovi priznani uporabnosti kot herbicidi v praktične namene uporablja omejeno število sredstev proti mikrotubulom.
Streptomyces je rod iz družine Streptomyces, ki vključuje aerobne, gram-pozitivne, nitaste bakterije in je splošno znan po svoji sposobnosti proizvajanja širokega spektra sekundarnih metabolitov.Zato velja za enega najpomembnejših virov novih biološko aktivnih naravnih izdelkov.V trenutni študiji smo odkrili novo spojino, imenovano kumamonamid, ki je bila izolirana iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 in S. werraensis ISP 5486. S spektralno analizo in popolno spektralno analizo smo okarakterizirali strukturo kumamonamida in njegovo edinstveno okostje N-alkoksipirola je bil določen.sinteza.Ugotovljeno je bilo, da ursmonska kislina, sintetični intermediat ursmonoamida in njegovih derivatov, zavira rast in kalitev priljubljene modelne rastline Arabidopsis thaliana.V študiji razmerja med strukturo in aktivnostjo smo ugotovili, da spojina s C9, modificirano v ursonsko kislino, imenovana noniloksi derivat ursonske kisline (KAND), znatno poveča zaviralni učinek na rast in kalitev.Predvsem novoodkriti zaviralec rasti rastlin je vplival tudi na rast tobaka in jetrnika in ni bil citotoksičen za bakterije ali celice HeLa.Poleg tega nekateri derivati urmotonske kisline inducirajo izkrivljen koreninski fenotip, kar pomeni, da ti derivati neposredno ali posredno vplivajo na mikrotubule.V skladu s to idejo naša opažanja mikrotubulov, označenih imunohistokemično ali s fluorescenčnimi proteini, kažejo, da zdravljenje s KAND depolimerizira mikrotubule.Poleg tega je zdravljenje z derivati kumamotonske kisline porušilo aktinske mikrofilamente.Tako smo odkrili nov zaviralec rasti rastlin, katerega edinstven mehanizem delovanja vključuje uničenje citoskeleta.
Sev MK493-CF1 je bil izoliran iz zemlje v Shinagawa-ku v Tokiu.Sev MK493-CF1 je tvoril dobro razvejan stromalni micelij.Določeno je bilo delno zaporedje gena 16S ribosomske RNA (1422 bp).Ta sev je zelo podoben S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipičen sev, 99,93 %).Na podlagi tega rezultata je bilo ugotovljeno, da je ta sev tesno povezan s tipskim sevom S. werraensis.Zato smo ta sev začasno poimenovali S. werraensis MK493-CF1.Tudi S. werraensis ISP 5486T proizvaja enake bioaktivne spojine.Ker je bilo zgodnjih raziskav o pridobivanju naravnih produktov iz tega mikroorganizma malo, so bile izvedene nadaljnje kemijske raziskave.Po gojenju S. werraensis MK493-CF1 na ječmenovem mediju s fermentacijo v trdnem stanju pri 30 °C 14 dni smo medij ekstrahirali s 50 % EtOH.60 ml vzorca smo posušili, da smo dobili 59,5 mg surovega ekstrakta.Surovi ekstrakt smo izpostavili HPLC z reverzno fazo, da smo dobili N-metoksi-lH-pirol-2-karboksamid (1, imenovan kumamonamid, 36,0 mg).Skupna količina 1 je približno 60% surovega ekstrakta.Zato smo se odločili podrobno preučiti lastnosti kumamotoamida 1.
Kumamonamid 1 je bel amorfen prah in masna spektrometrija visoke ločljivosti (HRESIMS) potrjuje C6H8N2O2 (slika 1).Za C2-substituiran pirolni fragment te spojine je značilno δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH v 1H NMR spektru: 4,5 Hz , H-5) in δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 13C NMR spekter pa kaže prisotnost štirih sp2 ogljikovih atomov.Prisotnost amidne skupine na položaju C2 je bila ocenjena s korelacijo HMBC od protona C-3 do amidnega karbonilnega ogljika pri δC 161,1.Poleg tega vrhovi 1 H in 13 C NMR pri δH 4,10 (3H, S) in δC 68,3 kažejo na prisotnost N-metoksi skupin v molekuli.Čeprav pravilni položaj metoksi skupine še ni bil določen z uporabo spektroskopske analize, kot sta spektroskopija z izboljšano razliko in jedrska okrajšava Overhauser (NOEDF), je N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid postal prva kandidatna spojina.
Za določitev pravilne strukture 1 je bila izvedena popolna sinteza (slika 2a).Obdelava komercialno dostopnega 2-aminopiridina 2 z m-CPBA je povzročila ustrezen N-oksid 3 v kvantitativnem izkoristku.Po 2-aminoazidaciji 2 smo izvedli reakcijo ciklokondenzacije, ki jo je opisal Abramovič, v benzenu pri 90 °C, da smo dobili želeni 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 v gramih.Hitrost 60% (dve stopnji).15,16.Z metilacijo in hidrolizo 4 smo nato dobili 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilno kislino (imenovano "kumotonska kislina", 6) v dobrem izkoristku (70 %, dve stopnji).Končno je amidacija preko intermediata 6 kislinskega klorida z uporabo vodne raztopine amoniaka dala Kumamotov amid 1 v 98 % izkoristku.Vsi spektralni podatki sintetiziranega 1 so bili podobni izoliranemu 1, zato je bila struktura 1 določena;
Splošna sinteza in analiza biološke aktivnosti urbenamida in urbenske kisline.(a) Popolna sinteza Kumamoto amida.(b) Sedem dni stare sadike divjega tipa Arabidopsis Columbia (Col) so bile vzgojene na ploščah Murashige in Skoog (MS), ki so vsebovale kumamonamid 6 ali kumamonamid 1 v navedenih koncentracijah.Merilo = 1 cm.
Najprej smo ocenili biološke aktivnosti urbenamida in njegovih intermediatov za njihovo sposobnost moduliranja rasti rastlin.Gojišču MS agar smo dodali različne koncentracije ursmonamida 1 ali ursmonske kisline 6 in na tem gojišču gojili sadike Arabidopsis thaliana.Ti testi so pokazali, da visoke koncentracije (500 μM) 6 zavirajo rast korenin (slika 2b).Nato smo ustvarili različne derivate z zamenjavo položaja N1 za 6 in na njih izvedli študije razmerja med strukturo in aktivnostjo (postopek analogne sinteze je opisan v podpornih informacijah (SI)).Sadike Arabidopsis smo vzgojili na gojišču s 50 μM derivatov ursonske kisline in izmerili dolžino korenin.kot je prikazano na sliki.Kot je prikazano na slikah 3a, b in S1, imajo kumamo kisline različne dolžine linearnih alkoksi verig (9, 10, 11, 12 in 13) ali velikih alkoksi verig (15, 16 in 17) na položaju N1.Derivati so pokazali znatno inhibicijo rasti korenin.Poleg tega smo ugotovili, da uporaba 200 μM 10, 11 ali 17 zavira kalitev (sliki 3c in S2).
Študija razmerja med strukturo in aktivnostjo Kumamotovega amida in sorodnih spojin.(a) Struktura in sintezna shema analogov.(b) Kvantifikacija dolžine korenin 7 dni starih sadik, gojenih na MS mediju z ali brez 50 μM derivatov kumamonamida.Zvezdice označujejo pomembne razlike z navideznim zdravljenjem (t test, str< 0,05).n>18. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD.nt pomeni "ni testirano", ker več kot 50 % semen ni vzklilo.( c ) Kvantifikacija stopnje kalitve tretiranih semen, inkubiranih 7 dni v MS mediju z ali brez 200 μM kumamonamida in sorodnih spojin.Zvezdice označujejo pomembne razlike z navideznim zdravljenjem (hi-kvadrat test).n=96.
Zanimivo je, da je dodatek alkilnih stranskih verig, daljših od C9, zmanjšal inhibitorno aktivnost, kar nakazuje, da spojine, povezane s kumamotojsko kislino, potrebujejo stranske verige določene velikosti, da pokažejo svojo biološko aktivnost.
Ker je analiza razmerja med strukturo in aktivnostjo pokazala, da je bil C9 modificiran v ursonsko kislino in je noniloksi derivat ursonske kisline (v nadaljevanju KAND 11) najučinkovitejši zaviralec rasti rastlin, smo izvedli podrobnejšo karakterizacijo KAND 11. Zdravljenje Arabidopsis s 50 μM KAND 11 je skoraj popolnoma preprečil kalitev, medtem ko so nižje koncentracije (40, 30, 20 ali 10 μM) KAND 11 zavirale rast korenin na način, ki je odvisen od odmerka (sl. 4a, b).Da bi preizkusili, ali KAND 11 vpliva na sposobnost preživetja koreninskega meristema, smo pregledali meristeme korenin, obarvane s propidijevim jodidom (PI), in izmerili velikost površine meristema.Velikost meristema sadik, vzgojenih na gojišču s 25 μM KAND-11, je bila 151,1 ± 32,5 μm, velikost meristema sadik, vzgojenih na kontrolnem gojišču z DMSO, pa 264,7 ± 30,8 μm (slika 4c, d) , kar kaže, da KAND-11 obnavlja celično aktivnost.širjenje.Koreninski meristem.V skladu s tem je zdravljenje s KAND 11 zmanjšalo količino signala markerja celične delitve CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS v koreninskem meristemu (slika 4e) 17 .Ti rezultati kažejo, da KAND 11 zavira rast korenin z zmanjšanjem aktivnosti celične proliferacije.
Analiza inhibitornega učinka derivatov urbenonske kisline (urbeniloksi derivatov) na rast.(a) 7-dnevne sadike divjega tipa Col, gojene na MS ploščah z navedenimi koncentracijami KAND 11. Lestvica = 1 cm.(b) Kvantifikacija dolžine korenine.Črke označujejo pomembne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).n>16. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD.(c) Konfokalna mikroskopija korenin divjega tipa Col, obarvanih s propidijevim jodidom, gojenih na MS ploščah z ali brez 25 μM KAND 11. Beli oklepaji označujejo koreninski meristem.Lestvica = 100 µm.(d) Kvantifikacija velikosti koreninskega meristema (n = 10 do 11).Statistične razlike so bile določene s t-testom (str< 0,05).Vrstice predstavljajo povprečno velikost meristema.(e) mikroskopija z diferencialnim interferenčnim kontrastom (DIC) koreninskega meristema, ki vsebuje konstrukt CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS obarvan in obarvan na 5 dni starih sadikah, gojenih na MS ploščah z ali brez 25 µM KAND testa.
Fitotoksičnost KAND 11 je bila nadalje preizkušena z uporabo druge dvodomne rastline, tobaka (Nicotiana tabacum), in glavnega modelnega organizma kopenske rastline, jetrnika (Marchantia polymorpha).Kot v primeru Arabidopsis so sadike tobaka SR-1, gojene na mediju, ki je vseboval 25 μM KAND 11, dale krajše korenine (slika 5a).Poleg tega je 40 od 48 semen vzklilo na ploščah, ki vsebujejo 200 μM KAND 11, medtem ko je vseh 48 semen vzklilo na lažno obdelanih gojiščih, kar kaže, da so bile višje koncentracije KAND pomembne (p< 0,05;chi test -kvadrat) zavira kalitev tobaka.(slika 5b).Poleg tega je bila koncentracija KAND 11, ki je zavirala rast bakterij v jetrniku, podobna učinkoviti koncentraciji v Arabidopsisu (slika 5c).Ti rezultati kažejo, da lahko KAND 11 zavira rast različnih rastlin.Nato smo raziskali možno citotoksičnost spojin, povezanih z medvedjim monoamidom, v drugih organizmih, in sicer v človeških celicah HeLa in sevu Escherichia coli DH5α, kot predstavnikih višjih živalskih oziroma bakterijskih celic.V seriji testov celične proliferacije smo opazili, da kumamonamid 1, kumamonamidna kislina 6 in KAND 11 niso vplivali na rast celic HeLa ali E. coli pri koncentracijah 100 μM (slika 5d,e).
Zaviranje rasti KAND 11 v organizmih, ki niso Arabidopsis.(a) Dva tedna stare sadike tobaka divjega tipa SR-1 smo gojili na navpično postavljenih ploščah MS, ki vsebujejo 25 μM KAND 11. (b) Dva tedna stare sadike tobaka divjega tipa SR-1 smo gojili na vodoravno postavljenih Plošče MS, ki vsebujejo 200 μM KAND 11. ( c ) Dva tedna stari popki jetrnika Tak-1 divjega tipa, gojeni na ploščah Gamborg B5 z navedenimi koncentracijami KAND 11. Rdeče puščice označujejo spore, ki so prenehale rasti med dvotedensko inkubacijo obdobje.(d) Test celične proliferacije celic HeLa.Število celic, sposobnih za življenje, smo merili v določenih časovnih intervalih z uporabo kompleta za štetje celic 8 (Dojindo).Kot kontrolo smo celice HeLa obdelali s 5 μg/ml aktinomicina D (Act D), ki zavira transkripcijo RNA polimeraze in povzroči celično smrt.Analize so bile izvedene v treh izvodih.(e) Test proliferacije celic E. coli.Rast E. coli smo analizirali z merjenjem OD600.Kot kontrolo smo celice obdelali s 50 μg/ml ampicilina (Amp), ki zavira sintezo bakterijske celične stene.Analize so bile izvedene v treh izvodih.
Da bi dešifrirali mehanizem delovanja citotoksičnosti, ki jo povzročajo uramidom sorodne spojine, smo ponovno analizirali derivate urbenske kisline z zmernimi inhibitornimi učinki.kot je prikazano na sliki.Kot je prikazano na slikah 2b, 6a, so sadike, gojene na agar ploščah, ki vsebujejo visoke koncentracije (200 μM) urmotonske kisline 6, proizvedle krajše in levo ukrivljene korenine (θ = – 23,7 ± 6,1), medtem ko so sadike, gojene na kontrolnem mediju, sadike so pognale skoraj ravne korenine (θ = – 3,8 ± 7,1).Znano je, da je ta značilna poševna rast posledica disfunkcije kortikalnih mikrotubulov 14, 18.V skladu s to ugotovitvijo sta dizopiramid in orizalin, ki destabilizirata mikrotubule, povzročila podobno nagibanje korenin v naših pogojih rasti (sliki 2b, 6a).Hkrati smo testirali derivate urmotonske kisline in izbrali nekaj izmed njih, ki so v določenih koncentracijah inducirali poševno rast korenin.Spojine 8, 9 in 15 so spremenile smer rasti korenin pri 75 μM, 50 μM oziroma 40 μM, kar kaže, da lahko te spojine učinkovito destabilizirajo mikrotubule (sl. 2b, 6a).Testirali smo tudi najmočnejši derivat ursolne kisline, KAND 11, pri nižji koncentraciji (15 µM) in ugotovili, da uporaba KAND 11 zavira rast korenin in da je bila smer rasti korenin neenakomerna, čeprav so bile nagnjene v levo ( Slika C3)..Ker višje koncentracije zdravil, ki destabilizirajo mikrotubule, včasih zavirajo rast rastlin, namesto da povzročijo nagibanje korenin, smo naknadno ocenili možnost, da KAND 11 vpliva na mikrotubule z opazovanjem kortikalnih mikrotubulov v koreninskih epidermalnih celicah.Imunohistokemija z uporabo protiteles proti β-tubulinu v epidermalnih celicah korenin sadik, obdelanih s 25 μM KAND 11, je pokazala izginotje skoraj vseh kortikalnih mikrotubulov v epidermalnih celicah v coni raztezka (slika 6b).Ti rezultati kažejo, da kumamotonska kislina in njeni derivati delujejo neposredno ali posredno na mikrotubule, da jih motijo, in da so te spojine novi zaviralci mikrotubulov.
Ursonska kislina in njeni derivati spreminjajo kortikalne mikrotubule v Arabidopsis thaliana.(a) Kot naklona korenine, izmerjen v prisotnosti različnih derivatov urmotonske kisline pri navedenih koncentracijah.Analizirani so bili tudi učinki dveh spojin, za katere je znano, da zavirata mikrotubule: disopiramida in orizalina.Vložek prikazuje standard, ki se uporablja za merjenje kota rasti korenin.Zvezdice označujejo pomembne razlike z navideznim zdravljenjem (t test, str< 0,05).n>19. Merilo = 1 cm.( b ) Kortikalni mikrotubuli v epidermalnih celicah v območju raztezka.Mikrotubule v koreninah divjega tipa Arabidopsis Col, gojenih na ploščah MS z ali brez 25 μM KAND 11, smo vizualizirali z imunohistokemičnim barvanjem z uporabo primarnih protiteles β-tubulina in sekundarnih protiteles, konjugiranih z Alexa Fluor.Lestvica = 10 µm.(c) Mitotična struktura mikrotubulov v koreninskem meristemu.Mikrotubule smo vizualizirali z imunohistokemičnim barvanjem.Mitotične strukture, vključno s profaznimi conami, vreteni in fragmoplasti, so bile preštete iz konfokalnih slik.Puščice označujejo strukture mitotskih mikrotubulov.Zvezdice označujejo pomembne razlike z navideznim zdravljenjem (t test, str< 0,05).n>9. Lestvica = 50 µm.
Čeprav lahko Ursa moti funkcijo mikrotubulov, se pričakuje, da bo njen mehanizem delovanja drugačen od tipičnih sredstev za depolimerizacijo mikrotubulov.Na primer, višje koncentracije sredstev za depolimerizacijo mikrotubulov, kot sta dizopiramid in orizalin, povzročijo anizotropno širjenje epidermalnih celic, medtem ko KAND 11 ne.Poleg tega je sočasna uporaba KAND 11 in disopiramida povzročila kombiniran odgovor na rast korenin, ki ga povzroča disopiramid, in opazili so zaviranje rasti, ki ga povzroča KAND 11 (slika S4).Analizirali smo tudi odziv preobčutljivega mutanta dizopiramida 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 ima nekanonično točkovno mutacijo tubulin kinaze in proizvaja krajše korenine, ko ga zdravimo z dizopiramidom9,20.mutirane sadike phs1-1, gojene na agarskem mediju, ki je vseboval KAND 11, so imele krajše korenine, podobne tistim, gojenim na dizopiramidu (slika S5).
Poleg tega smo opazili strukture mitotskih mikrotubulov, kot so profazne cone, vretena in fragmoplasti, v koreninskem meristemu sadik, tretiranih s KAND 11. V skladu z opažanji za CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS je prišlo do znatnega zmanjšanja opazili smo število mitotskih mikrotubulov (slika .6c).
Za karakterizacijo citotoksičnosti KAND 11 pri subcelični ločljivosti smo obdelali suspenzijske celice tobaka BY-2 s KAND 11 in opazovali njihov odziv.Najprej smo celicam BY-2, ki izražajo TagRFP-TUA6, ki fluorescentno označuje mikrotubule, dodali KAND 11, da ocenimo učinek KAND 11 na kortikalne mikrotubule.Gostota kortikalnih mikrotubulov je bila ocenjena z analizo slike, ki je kvantificirala odstotek citoskeletnih pikslov med citoplazemskimi piksli.Rezultati testa so pokazali, da se je po 1-urni obdelavi s 50 μM ali 100 μM KAND 11 gostota znatno zmanjšala na 0,94 ± 0,74 % oziroma 0,23 ± 0,28 %, medtem ko je gostota celic, obdelanih z DMSO, znašala 1,61 ± 0,34. % (slika 7a).Ti rezultati so skladni z opažanjem pri Arabidopsisu, da zdravljenje s KAND 11 inducira depolimerizacijo kortikalnih mikrotubulov (slika 6b).Pregledali smo tudi linijo BY-2 z aktinskimi filamenti, označenimi z GFP-ABD, po obdelavi z enako koncentracijo KAND 11 in opazili, da je zdravljenje s KAND 11 motilo aktinske filamente.Zdravljenje s 50 μM ali 100 μM KAND 11 za 1 uro je znatno zmanjšalo gostoto aktinskih filamentov na 1,20 ± 0,62 % oziroma 0,61 ± 0,26 %, medtem ko je bila gostota v celicah, obdelanih z DMSO, 1,69 ± 0,51 % (slika 2).7b).Ti rezultati so v nasprotju z učinki propizamida, ki ne vpliva na aktinske filamente, in latrunculina B, depolimerizatorja aktina, ki ne vpliva na mikrotubule (SI Slika S6).Poleg tega zdravljenje s kumamonamidom 1, kumamonamidno kislino 6 ali KAND 11 ni vplivalo na mikrotubule v celicah HeLa (SI slika S7).Zato se domneva, da je mehanizem delovanja KAND 11 drugačen od mehanizma znanih motilcev citoskeleta.Poleg tega je naše mikroskopsko opazovanje celic BY-2, zdravljenih s KAND 11, razkrilo začetek celične smrti med zdravljenjem s KAND 11 in pokazalo, da se delež Evans modro obarvanih mrtvih celic po 30 minutah zdravljenja s KAND 11 ni bistveno povečal, medtem ko po 90 minutah zdravljenja s 50 μM ali 100 μM KAND se je število mrtvih celic povečalo na 43,7 % oziroma 80,1 % (slika 7c).Ti podatki skupaj kažejo, da je novi derivat ursolne kisline KAND 11 za rastlino specifičen citoskeletni inhibitor s prej neznanim mehanizmom delovanja.
KAND vpliva na kortikalne mikrotubule, aktinske filamente in sposobnost preživetja celic BY-2 tobaka.( a ) Vizualizacija kortikalnih mikrotubulov v celicah BY-2 v prisotnosti TagRFP-TUA6.Celice BY-2, obdelane s KAND 11 (50 μM ali 100 μM) ali DMSO, smo pregledali s konfokalno mikroskopijo.Gostota kortikalnih mikrotubulov je bila izračunana iz mikrografov 25 neodvisnih celic.Črke označujejo pomembne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).Lestvica = 10 µm.( b ) Kortikalni aktinski filamenti v celicah BY-2, vizualizirani v prisotnosti GFP-ABD2.Celice BY-2, obdelane s KAND 11 (50 μM ali 100 μM) ali DMSO, smo pregledali s konfokalno mikroskopijo.Gostota kortikalnih aktinskih filamentov je bila izračunana iz mikrofotografij 25 neodvisnih celic.Črke označujejo pomembne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).Lestvica = 10 µm.( c ) Opazovanje mrtvih celic BY-2 z Evansovim modrim barvanjem.Celice BY-2, obdelane s KAND 11 (50 μM ali 100 μM) ali DMSO, smo pregledali z mikroskopijo v svetlem polju.n=3.Lestvica = 100 µm.
Odkritje in uporaba novih naravnih proizvodov je pripeljalo do pomembnega napredka v različnih vidikih človeškega življenja, vključno z medicino in kmetijstvom.Zgodovinske raziskave so bile izvedene za pridobivanje uporabnih spojin iz naravnih virov.Zlasti je znano, da so aktinomicete uporabne kot antiparazitski antibiotiki za ogorčice zaradi svoje sposobnosti proizvajanja različnih sekundarnih metabolitov, kot je avermektin, glavna spojina ivermektina in bleomicina ter njegovih derivatov, ki se v medicini uporabljajo kot sredstvo proti raku 21, 22.Podobno so bile iz aktinomicet odkrite različne herbicidne spojine, od katerih se nekatere že uporabljajo v komercialne namene1,23.Zato se analiza metabolitov aktinomicet za izolacijo naravnih produktov z želenimi biološkimi aktivnostmi šteje za učinkovito strategijo.V tej študiji smo odkrili novo spojino, kumamonamid, iz S. werraensis in jo uspešno sintetizirali.Ursonska kislina je sintetični intermediat urbenamida in njegovih derivatov.Lahko povzroči značilno zvijanje korenin, kaže zmerno do močno herbicidno delovanje in neposredno ali posredno poškoduje rastlinske mikrotubule.Vendar pa se mehanizem delovanja urmotonične kisline lahko razlikuje od mehanizma obstoječih zaviralcev mikrotubulov, saj KAND 11 moti tudi aktinske filamente in povzroči celično smrt, kar kaže na regulativni mehanizem, s katerim urmotonična kislina in njeni derivati vplivajo na širok spekter citoskeletnih struktur..
Nadaljnja podrobna karakterizacija urbenonske kisline bo pomagala bolje razumeti mehanizem delovanja urbenonske kisline.Zlasti naslednji cilj je oceniti sposobnost ursonske kisline, da se veže na reducirane mikrotubule, da bi ugotovili, ali ursonska kislina in njeni derivati delujejo neposredno na mikrotubule in jih depolimerizirajo, ali pa njihovo delovanje povzroči destabilizacijo mikrotubulov.Poleg tega bo v primeru, ko mikrotubuli niso neposredna tarča, prepoznavanje mesta delovanja in molekularnih tarč ursonske kisline na rastlinskih celicah pomagalo pri nadaljnjem razumevanju lastnosti sorodnih spojin in možnih načinov za izboljšanje herbicidnega delovanja.Naš test bioaktivnosti je razkril edinstveno citotoksično sposobnost ursonske kisline na rast rastlin, kot so Arabidopsis thaliana, tobak in jetrnik, medtem ko niso bile prizadete niti celice E. coli niti HeLa.Majhna ali nič toksičnosti za živalske celice je prednost derivatov ursonske kisline, če so razviti kot herbicidi za uporabo na odprtih kmetijskih poljih.Ker so mikrotubuli običajne strukture v evkariontih, je njihova selektivna inhibicija v rastlinah ključna zahteva za herbicide.Na primer, propyzamid, sredstvo za depolimerizacijo mikrotubulov, ki se neposredno veže na tubulin in zavira polimerizacijo, se uporablja kot herbicid zaradi njegove nizke toksičnosti za živalske celice24.V nasprotju z dizopiramidom imajo sorodni benzamidi drugačne ciljne specifičnosti.Poleg rastlinskih mikrotubulov RH-4032 ali benzoksamid zavira tudi mikrotubule živalskih celic oziroma oomicet, zalilamid pa se zaradi nizke fitotoksičnosti uporablja kot fungicid25,26,27.Na novo odkriti medved in njegovi derivati kažejo selektivno citotoksičnost proti rastlinam, vendar je treba omeniti, da lahko nadaljnje modifikacije spremenijo njihovo ciljno specifičnost, kar lahko zagotovi dodatne derivate za nadzor patogenih gliv ali oomicet.
Edinstvene lastnosti urbenonske kisline in njenih derivatov so uporabne za njihov razvoj kot herbicidov in uporabo kot raziskovalno orodje.Pomen citoskeleta pri nadzoru oblike rastlinskih celic je splošno priznan.Prejšnje študije so pokazale, da so rastline razvile kompleksne mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubulov z nadzorom dinamike mikrotubulov za pravilen nadzor morfogeneze.Identificiranih je bilo veliko število molekul, ki so odgovorne za uravnavanje aktivnosti mikrotubulov, s tem povezane raziskave pa še vedno potekajo3,4,28.Naše trenutno razumevanje dinamike mikrotubulov v rastlinskih celicah ne razloži v celoti mehanizmov organizacije kortikalnih mikrotubulov.Na primer, čeprav lahko tako disopiramid kot orizalin depolimerizirata mikrotubule, dizopiramid povzroči resno deformacijo korenin, medtem ko ima orizalin razmeroma blag učinek.Poleg tega mutacije v tubulinu, ki stabilizira mikrotubule, povzročijo tudi desno rotacijo v koreninah, medtem ko paklitaksel, ki prav tako stabilizira dinamiko mikrotubulov, ne.Zato bi moralo preučevanje in prepoznavanje molekularnih tarč ursolne kisline zagotoviti nov vpogled v regulacijo rastlinskih kortikalnih mikrotubulov.Podobno bodo prihodnje primerjave kemikalij, ki so učinkovite pri spodbujanju izkrivljene rasti, kot je dizopiramid, in manj učinkovitih kemikalij, kot sta orizalin ali kumamotorna kislina, zagotovile namige o tem, kako pride do izkrivljene rasti.
Po drugi strani pa so z obrambo povezane citoskeletne preureditve še ena možnost za razlago citotoksičnosti ursonske kisline.Okužba s patogenom ali vnos elicitorja v rastlinske celice včasih povzroči uničenje citoskeleta in posledično celično smrt29.Na primer, poročali so, da kriptoksantin, pridobljen iz oomicet, moti mikrotubule in aktinske filamente pred smrtjo celic tobaka, podobno kot se zgodi pri zdravljenju s KAND 30,31.Podobnosti med obrambnimi odzivi in celičnimi odzivi, ki jih povzroča ursonska kislina, so nas pripeljale do hipoteze, da sprožijo običajne celične procese, čeprav je očiten hitrejši in močnejši učinek ursonske kisline kot kriptoksantina.Vendar pa so študije pokazale, da motnje aktinskih filamentov spodbujajo spontano celično smrt, ki je ne spremlja vedno motnja mikrotubulov29.Poleg tega je treba še ugotoviti, ali povzročitelj ali povzročitelj povzroči izkrivljeno rast korenin, kot to počnejo derivati ursonske kisline.Tako je molekularno znanje, ki povezuje obrambne odzive in citoskelet, privlačen problem, ki ga je treba obravnavati.Z izkoriščanjem prisotnosti spojin z nizko molekulsko maso, povezanih z ursonsko kislino, kot tudi niza derivatov z različnimi močmi, lahko zagotovijo priložnosti za ciljanje na neznane celične mehanizme.
Skupaj bosta odkritje in uporaba novih spojin, ki modulirajo dinamiko mikrotubulov, zagotovila zmogljive metode za obravnavanje kompleksnih molekularnih mehanizmov, ki so podlaga za določanje oblike rastlinskih celic.V tem kontekstu lahko nedavno razvita spojina urmotonična kislina, ki vpliva na mikrotubule in aktinske filamente ter inducira celično smrt, ponudi priložnost za dešifriranje povezave med nadzorom mikrotubulov in temi drugimi mehanizmi.Tako nam bo kemijska in biološka analiza z uporabo urbenonske kisline pomagala razumeti molekularne regulacijske mehanizme, ki nadzorujejo rastlinski citoskelet.
Inokulirajte S. werraensis MK493-CF1 v 500 ml erlenmajerico s pregrado, ki vsebuje 110 ml gojišča za sejanje, sestavljenega iz 2 % (m/v) galaktoze, 2 % (m/v) paste Essence, 1 % (m/v) Bacto sestava .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (m/v) ekstrakt koruze (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonska), 0,2 % (m/v) (NH4)2SO4 in 0,2 % CaCO3 v deionizirani vodi.(pH 7,4 pred sterilizacijo).Semenske kulture smo 2 dni inkubirali na rotacijskem stresalniku (180 rpm) pri 27 °C.Gojenje proizvodnje s fermentacijo v trdnem stanju.Semensko kulturo (7 ml) smo prenesli v 500 ml bučko K-1, ki je vsebovala 40 g proizvodnega medija, sestavljenega iz 15 g stisnjenega ječmena (MUSO Co., Ltd., Japonska) in 25 g deionizirane vode (pH ni nastavljen pred sterilizacijo).).Fermentacijo smo izvajali pri 30°C v temi 14 dni.Fermentacijski material smo ekstrahirali s 40 ml/plastenko EtOH in centrifugirali (1500 g, 4 °C, 10 min).Supernatant kulture (60 ml) ekstrahiramo z mešanico 10 % MeOH/EtOAc.Organsko plast smo uparili pod znižanim tlakom, da smo dobili ostanek (59,5 mg), ki smo ga izpostavili HPLC z gradientno elucijo (0–10 minut: 90 %) na reverzno fazni koloni (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dolžina 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90 % H2O/CH3CN do 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minut: 90 % H2O /EtOH do 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) pri pretoku 1,5 ml/min smo izolirali kumamonamid (1, 36,0 mg) kot bel amorfen prah.
kumamotoamid (1);1H-NMR (500 MHz, CDC13) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ izračunana vrednost: 141,0659, izmerjena vrednost: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Semena Columbia (Col-0) so bila pridobljena iz Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) z dovoljenjem za raziskovalno uporabo.Semena Col-0 smo razmnoževali in vzdrževali v naših laboratorijskih pogojih ter uporabljali kot divje vrste rastlin Arabidopsis.Semena Arabidopsis smo površinsko sterilizirali in gojili v polovičnem mediju Murashige in Skoog, ki je vseboval 2 % saharoze (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (m/v) 2-(4-morfolino)etansulfonske kisline (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) in 1,5 % agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pri 23 °C in stalni svetlobi.Semena mutanta phs1-1 je zagotovil T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Semena seva SR-1 je zagotovil T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) in so bila uporabljena kot rastline divjega tipa tobaka.Tobačna semena so bila površinsko sterilizirana in tri noči namočena v sterilni vodi, da bi spodbudila kalitev, nato pa so bila dana v polovično raztopino, ki je vsebovala 2 % saharoze, 0,05 % (m/v) MES in 0,8 % gelan gumija (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.in medij Skoog) s pH 5,7 in inkubiramo pri 23 °C pri stalni svetlobi.
Sev Tak-1 je zagotovil T. Kohchi (Kjotska univerza) in je bil uporabljen kot standardna eksperimentalna enota za študijo jetrnika.Gemma je bila pridobljena iz steriliziranih gojenih rastlin in nato nanesena na medij Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), ki je vseboval 1 % saharoze in 0,3 % gelan gumija, in inkubirana pri 23 °C pod neprekinjeno svetlobo.
Celice tobaka BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) je zagotovil S. Hasezawa (Univerza v Tokiu).Celice BY-2 smo 95-krat razredčili v modificiranem Linsmeierjevem in Skoogovem mediju in tedensko dopolnili z 2,4-diklorofenoksiocetno kislino 32 .Celično suspenzijo smo mešali na rotacijskem stresalniku pri 130 obratih na minuto pri 27 °C v temi.Celice speremo z 10-kratnim volumnom svežega medija in resuspendiramo v istem mediju.Transgene celične linije BY-2, ki stabilno izražajo marker mikrotubulov TagRFP-TUA6 ali marker aktinskih filamentov GFP-ABD2 pod promotorjem 35S virusa mozaika cvetače, so bile ustvarjene, kot je opisano 33, 34, 35.Te celične linije je mogoče vzdrževati in sinhronizirati z uporabo postopkov, podobnih tistim, uporabljenim za prvotno celično linijo BY-2.
Celice HeLa smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM) (Life Technologies), dopolnjenem z 10 % fetalnega govejega seruma, 1,2 E/ml penicilina in 1,2 μg/ml streptomicina v inkubatorju pri 37 °C s 5 % CO2.
Vsi poskusi, opisani v tem rokopisu, so bili izvedeni v skladu z japonskimi predpisi in smernicami o biološki varnosti.
Spojine smo raztopili v dimetil sulfoksidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kot osnovne raztopine in razredčili v mediju MS za Arabidopsis in tobak ali mediju Gamborg B5 za jetrnico.Za test inhibicije rasti korenin je bilo več kot 10 semen na ploščo posejanih na agarno gojišče, ki je vsebovalo navedene spojine ali DMSO.Semena smo inkubirali v rastni komori 7 dni.Sadike smo fotografirali in izmerili dolžino korenin.Za preizkus kalitve Arabidopsis je bilo 48 semen na ploščo posejanih na agarni medij, ki je vseboval 200 μM spojine ali DMSO.Semena Arabidopsis smo gojili v rastni komori in 7 dni po kalitvi (dag) prešteli število kaljenih sadik.Za test kalitve tobaka smo 24 semen na ploščo posejali na agarski medij, ki je vseboval 200 μM KAND ali DMSO.Seme tobaka smo gojili v rastni komori in po 14 dneh prešteli število kaljenih sadik.Za test inhibicije rasti jetrnice smo 9 zarodkov iz vsake plošče nasadili na agarski medij, ki je vseboval navedene koncentracije KAND ali DMSO, in jih inkubirali v rastni komori 14 dni.
Uporabite sadike, obarvane s 5 mg/ml propidijevega jodida (PI), da vizualizirate organizacijo koreninskega meristema.PI signale smo opazovali s fluorescenčno mikroskopijo z uporabo konfokalnega laserskega skenirnega mikroskopa TCS SPE (Leica Microsystems).
Histokemično obarvanje korenin z β-glukuronidazo (GUS) je bilo izvedeno v skladu s protokolom, ki sta ga opisala Malami in Benfey36.Sadike smo čez noč fiksirali v 90% acetonu, 1 uro obarvali z 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronske kisline v GUS pufru in jih dali v hidrirano raztopino kloraldehida.(8 g kloralhidrata, 2 ml vode in 1 ml glicerola) in opazovali z diferencialno interferenčno kontrastno mikroskopijo z uporabo mikroskopa Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Koreninske kote smo merili na 7 dni starih sadikah, vzgojenih na navpično postavljenih ploščah.Izmerite kot korena od smeri gravitacijskega vektorja, kot je opisano v koraku 6.
Razporeditev kortikalnih mikrotubulov smo opazili, kot je opisano, z manjšimi spremembami protokola 37 .Protitelesa proti β-tubulinu (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) in Alexa Fluor 488 konjugirana protimišja IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) so bila uporabljena kot primarna in sekundarna protitelesa v razredčitvah 1:1000 in 1:100, oz.Fluorescenčne slike so bile pridobljene z uporabo konfokalnega laserskega skenirajočega mikroskopa TCS SPE (Leica Microsystems).Pridobite slike Z-sklada in ustvarite projekcije največje intenzivnosti v skladu z navodili proizvajalca.
Test proliferacije celic HeLa je bil izveden z uporabo kompleta za štetje celic 8 (Dojindo) v skladu z navodili proizvajalca.
Rast E. coli DH5α smo analizirali z merjenjem celične gostote v kulturi s spektrofotometrom pri 600 nm (OD600).
Citoskeletno organizacijo v transgenih celicah BY-2 smo opazovali s fluorescenčnim mikroskopom, opremljenim s konfokalno skenirno napravo CSU-X1 (Yokogawa) in sCMOS kamero (Zyla, Andor Technology).Gostoto citoskeleta so ocenili z analizo slike, ki je kvantificirala odstotek citoskeletnih pikslov med citoplazemskimi piksli na konfokalnih slikah z uporabo programske opreme ImageJ, kot je opisano 38,39.
Za odkrivanje celične smrti v celicah BY-2 smo alikvot celične suspenzije inkubirali z 0,05 % Evans modrim 10 minut pri sobni temperaturi.Selektivno Evansovo modro obarvanje mrtvih celic je odvisno od iztiskanja barvila iz živih celic s strani intaktne plazemske membrane40.Obarvane celice smo opazovali z mikroskopom s svetlim poljem (BX53, Olympus).
Celice HeLa smo gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 % FBS, v vlažnem inkubatorju pri 37 °C in 5 % CO2.Celice smo obdelali s 100 μM KAND 11, kumamonamsko kislino 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml kolcemida (Gibco) ali 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 6 ur pri 37 °C.Celice smo fiksirali z MetOH 10 minut in nato z acetatom 5 minut pri sobni temperaturi.Fiksne celice so bile 2 uri inkubirane s primarnim protitelesom β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1), razredčenim v 0,5 % BSA/PBS, 3-krat sprane s TBST in nato inkubirane s kozjim protitelesom Alexa Fluor.488 1 uro.– Mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) in 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenilindola (DAPI), razredčenega v 0,5 % BSA/PBS.Po trikratnem izpiranju s TBST smo obarvane celice opazili na invertnem mikroskopu Nikon Eclipse Ti-E.Slike so bile posnete s hlajeno kamero Hamamatsu ORCA-R2 CCD z uporabo programske opreme MetaMorph (Molecular Devices).
Čas objave: 17. junij 2024