Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljše rezultate priporočamo, da uporabite novejšo različico brskalnika (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem, da bi zagotovili stalno podporo, spletno mesto prikazujemo brez stilov ali JavaScripta.
Odkritje in koristna uporaba naravnih produktov lahko izboljšata človeško življenje. Kemikalije, ki zavirajo rast rastlin, se pogosto uporabljajo kot herbicidi za zatiranje plevela. Zaradi potrebe po uporabi različnih vrst herbicidov je treba identificirati spojine z novimi mehanizmi delovanja. V tej študiji smo odkrili novo N-alkoksipirolno spojino, kumamonamid, iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 in vzpostavili celoten postopek sinteze. Z analizo biološke aktivnosti smo odkrili, da je urs-monoaminska kislina sintetični intermediat urs-monoamida in potencialna...zaviralec rasti rastlinPoleg tega smo razvili različne derivate urbenonske kisline, vključno z urbeniloksilnim derivatom (UDA), ki ima visoko herbicidno aktivnost, ne da bi negativno vplival na rast celic HeLa. Ugotovili smo tudi, da derivati urmotonske kisline motijo rastlinske mikrotubule; poleg tega KAND vpliva na aktinske filamente in povzroča celično smrt; ti večplastni učinki se razlikujejo od učinkov znanih zaviralcev mikrotubulov in kažejo na nov mehanizem delovanja ursonske kisline, kar predstavlja pomembno prednost pri razvoju novih herbicidov.
Odkritje in praktična uporaba koristnih naravnih produktov in njihovih derivatov je sredstvo za izboljšanje kakovosti človeškega življenja. Sekundarni metaboliti, ki jih proizvajajo mikroorganizmi, rastline in žuželke, so privedli do velikega napredka v medicini in kmetijstvu. Iz naravnih produktov so razvili številne antibiotike in zdravila proti levkemiji. Poleg tega so različne vrstepesticidiIz teh naravnih produktov se ekstrahirajo fungicidi in herbicidi za uporabo v kmetijstvu. Zlasti herbicidi za zatiranje plevela so pomembno orodje za povečanje pridelka v sodobnem kmetijstvu, različne vrste spojin pa se že komercialno uporabljajo. Več celičnih procesov v rastlinah, kot so fotosinteza, presnova aminokislin, sinteza celičnih sten, regulacija mitoze, signalizacija fitohormonov ali sinteza beljakovin, velja za tipične tarče herbicidov. Spojine, ki zavirajo delovanje mikrotubulov, so pogost razred herbicidov, ki vplivajo na rast rastlin z vplivom na mitotično regulacijo2.
Mikrotubule so sestavni deli citoskeleta in so v evkariontskih celicah široko ohranjene. Heterodimer tubulina je sestavljen iz α-tubulina in β-tubulina, ki tvorita linearne protofilamente mikrotubulov, pri čemer 13 protofilamentov tvori valjasto strukturo. Mikrotubule imajo v rastlinskih celicah več vlog, vključno z določanjem oblike celic, celične delitve in znotrajceličnega transporta3,4. Rastlinske celice vsebujejo mikrotubule pod interfazno plazemsko membrano in domneva se, da te tako imenovane kortikalne mikrotubule nadzorujejo organizacijo celuloznih mikrofibril z regulacijo kompleksov celulozne sintaze4,5. Kortikalne mikrotubule koreninskih epidermalnih celic, ki so prisotne v območju hitrega podaljševanja koreninskega vrha, se nahajajo lateralno, celulozna mikrovlakna pa sledijo tem mikrotubulom in omejujejo smer širjenja celic, s čimer spodbujajo anizotropno podaljševanje celic. Zato je delovanje mikrotubulov tesno povezano z morfologijo rastlin. Zamenjave aminokislin v genih, ki kodirajo tubulin, povzročajo nagibanje kortikalnih mikrotubulnih nizov in rast na levi ali desni strani pri Arabidopsis6,7. Podobno lahko mutacije v proteinih, povezanih z mikrotubulami, ki uravnavajo dinamiko mikrotubulov, povzročijo tudi popačeno rast korenin8,9,10,11,12,13. Poleg tega zdravljenje s herbicidi, ki motijo mikrotubule, kot je dizopiramid, znan tudi kot pretilaklor, povzroča tudi levostransko poševno rast korenin14. Ti podatki kažejo, da je natančna regulacija delovanja mikrotubulov ključnega pomena za določanje smeri rasti rastlin.
Odkrili so različne vrste zaviralcev mikrotubulov, ki so pomembno prispevala k raziskavam citoskeletov, pa tudi k kmetijstvu in medicini2. Zlasti orizalin, dinitroanilinske spojine, dizopiramid, benzamidu sorodne spojine in njihovi analogi lahko zavirajo delovanje mikrotubulov in s tem zavirajo rast rastlin. Zato se pogosto uporabljajo kot herbicidi. Ker pa so mikrotubule pomemben sestavni del rastlinskih in živalskih celic, je večina zaviralcev mikrotubulov citotoksičnih za obe vrsti celic. Zato se kljub njihovi priznani uporabnosti kot herbicidov v praktične namene uporablja omejeno število antimikrotubulnih sredstev.
Streptomyces je rod družine Streptomyces, ki vključuje aerobne, grampozitivne, nitaste bakterije in je splošno znan po svoji sposobnosti proizvajanja širokega spektra sekundarnih metabolitov. Zato velja za enega najpomembnejših virov novih biološko aktivnih naravnih produktov. V trenutni študiji smo odkrili novo spojino, imenovano kumamonamid, ki smo jo izolirali iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 in S. werraensis ISP 5486. Z uporabo spektralne analize in popolne spektralne analize smo okarakterizirali strukturo kumamonamida in določili njegov edinstven N-alkoksipirolni skelet. Ugotovljeno je bilo, da urmonska kislina, sintetični intermediat ursmonoamida in njegovih derivatov, zavira rast in kalitev priljubljene modelne rastline Arabidopsis thaliana. V študiji razmerja med strukturo in aktivnostjo smo ugotovili, da spojina s C9, modificirano v ursonsko kislino, imenovana noniloksi derivat ursonske kisline (KAND), znatno poveča zaviralni učinek na rast in kalitev. Omeniti velja, da je novoodkriti zaviralec rasti rastlin vplival tudi na rast tobaka in jetrnika ter ni bil citotoksičen za bakterije ali celice HeLa. Poleg tega nekateri derivati urmotonske kisline povzročajo popačen koreninski fenotip, kar pomeni, da ti derivati neposredno ali posredno vplivajo na mikrotubule. V skladu s to idejo naša opazovanja mikrotubulov, označenih bodisi imunohistokemično bodisi s fluorescentnimi beljakovinami, kažejo, da zdravljenje s KAND depolimerizira mikrotubule. Poleg tega je zdravljenje z derivati kumamotonske kisline motilo aktinske mikrofilamente. Tako smo odkrili nov zaviralec rasti rastlin, katerega edinstven mehanizem delovanja vključuje uničenje citoskeleta.
Sev MK493-CF1 je bil izoliran iz zemlje v okrožju Shinagawa-ku v Tokiu. Sev MK493-CF1 je tvoril dobro razvejan stromalni micelij. Določeno je bilo delno zaporedje gena 16S ribosomske RNA (1422 bp). Ta sev je zelo podoben sevu S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipičen sev, 99,93 %). Na podlagi tega rezultata je bilo ugotovljeno, da je ta sev tesno povezan s tipskim sevom S. werraensis. Zato smo ta sev začasno poimenovali S. werraensis MK493-CF1. Tudi S. werraensis ISP 5486T proizvaja iste bioaktivne spojine. Ker je bilo zgodnjih raziskav o pridobivanju naravnih produktov iz tega mikroorganizma malo, so bile izvedene nadaljnje kemijske raziskave. Po 14-dnevnem gojenju S. werraensis MK493-CF1 na ječmenovem gojišču s fermentacijo v trdnem stanju pri 30 °C smo gojišče ekstrahirali s 50 % EtOH. 60 ml vzorca smo posušili, da smo dobili 59,5 mg surovega ekstrakta. Surovi ekstrakt smo podvrgli HPLC z reverzno fazo, da smo dobili N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, imenovan kumamonamid, 36,0 mg). Skupna količina 1 je približno 60 % surovega ekstrakta. Zato smo se odločili, da podrobno preučimo lastnosti kumamotomida 1.
Kumamonamid 1 je bel amorfni prah, masna spektrometrija visoke ločljivosti (HRESIMS) pa potrjuje C6H8N2O2 (slika 1). C2-substituirani pirolni fragment te spojine je označen z δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH v 1H NMR spektru: 4,5 Hz, H-5) in δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 13C NMR spekter pa kaže prisotnost štirih sp2 ogljikovih atomov. Prisotnost amidne skupine na položaju C2 je bila ocenjena s korelacijo HMBC od protona C-3 do amidnega karbonilnega ogljika pri δC 161,1. Poleg tega vrhovi 1H in 13C NMR pri δH 4,10 (3H, S) in δC 68,3 kažejo na prisotnost N-metoksi skupin v molekuli. Čeprav pravilen položaj metoksi skupine še ni bil določen s spektroskopsko analizo, kot sta izboljšana diferenčna spektroskopija in jedrska Overhauserjeva okrajšava (NOEDF), je N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid postal prva kandidatna spojina.
Za določitev pravilne strukture 1 je bila izvedena popolna sinteza (slika 2a). Obdelava komercialno dostopnega 2-aminopiridina 2 z m-CPBA je dala ustrezen N-oksid 3 v kvantitativnem izkoristku. Po 2-aminoazidaciji 2 je bila izvedena ciklokondenzacijska reakcija, ki jo je opisal Abramovič, v benzenu pri 90 °C, da smo dobili želeni 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 v gramih. Hitrost 60 % (dve stopnji). 15,16. Metilacija in hidroliza 4 sta nato dali 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilno kislino (imenovano "kumotonska kislina", 6) v dobrem izkoristku (70 %, dva koraka). Končno je amidacija preko intermediata kislinskega klorida 6 z uporabo vodnega amoniaka dala Kumamotov amid 1 v 98 % izkoristku. Vsi spektralni podatki sintetiziranega 1 so bili podobni izoliranemu 1, zato je bila določena struktura 1;
Splošna sinteza in analiza biološke aktivnosti urbenamida in urbenske kisline. (a) Popolna sinteza Kumamotovega amida. (b) Sedem dni stare sadike divjega tipa Arabidopsis Columbia (Col) so bile gojene na ploščah Murashige in Skoog (MS), ki so vsebovale kumamonamid 6 ali kumamonamid 1 v navedenih koncentracijah. Merilo = 1 cm.
Najprej smo ocenili biološke aktivnosti urbenamida in njegovih intermediatov glede na njihovo sposobnost moduliranja rasti rastlin. V MS agar gojišče smo dodali različne koncentracije ursmonamida 1 ali ursmonske kisline 6 in na tem gojišču gojili sadike Arabidopsis thaliana. Ti testi so pokazali, da visoke koncentracije (500 μM) spojine 6 zavirajo rast korenin (slika 2b). Nato smo z zamenjavo položaja N1 spojine 6 ustvarili različne derivate in na njih izvedli študije razmerja med strukturo in aktivnostjo (postopek sinteze analogov je opisan v dodatnih informacijah (SI)). Sadike Arabidopsis smo gojili na gojišču, ki je vsebovalo 50 μM derivatov ursonske kisline, in izmerili dolžino korenin, kot je prikazano na sliki. Kot je prikazano na slikah 3a, b in S1, imajo kumamo kisline različne dolžine linearnih alkoksilnih verig (9, 10, 11, 12 in 13) ali velikih alkoksilnih verig (15, 16 in 17) na položaju N1. Derivati so pokazali znatno zaviranje rasti korenin. Poleg tega smo ugotovili, da je nanos 200 μM 10, 11 ali 17 zaviral kalitev (sliki 3c in S2).
Študija razmerja med strukturo in aktivnostjo Kumamotovega amida in sorodnih spojin. (a) Struktura in shema sinteze analogov. (b) Kvantifikacija dolžine korenin 7 dni starih sadik, gojenih na gojišču MS z ali brez 50 μM derivatov kumamonamida. Zvezdice označujejo pomembne razlike pri navidezni obdelavi (t-test, p< 0,05). n>18. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD. nt pomeni »ni testirano«, ker več kot 50 % semen ni kalilo. (c) Kvantifikacija stopnje kalivosti tretiranih semen, inkubiranih 7 dni v gojišču MS z ali brez 200 μM kumamonamida in sorodnih spojin. Zvezdice označujejo pomembne razlike v primerjavi s placebom (hi-kvadrat test). n=96.
Zanimivo je, da je dodatek alkilnih stranskih verig, daljših od C9, zmanjšal inhibitorno aktivnost, kar kaže na to, da spojine, sorodne kumamotski kislini, za izkazovanje svoje biološke aktivnosti potrebujejo stranske verige določene velikosti.
Ker je analiza razmerja med strukturo in aktivnostjo pokazala, da je bil C9 modificiran v ursonsko kislino in da je bil noniloksi derivat ursonske kisline (v nadaljevanju KAND 11) najučinkovitejši zaviralec rasti rastlin, smo izvedli podrobnejšo karakterizacijo KAND 11. Obdelava Arabidopsis s 50 μM KAND 11 je skoraj v celoti preprečila kalitev, medtem ko so nižje koncentracije (40, 30, 20 ali 10 μM) KAND 11 zavirale rast korenin na način, ki je odvisen od odmerka (slika 4a, b). Da bi preverili, ali KAND 11 vpliva na sposobnost preživetja koreninskih meristemov, smo pregledali koreninske meristeme, obarvane s propidijevim jodidom (PI), in izmerili velikost površine meristema. Velikost meristema sadik, vzgojenih na gojišču, ki je vsebovalo 25 μM KAND-11, je bila 151,1 ± 32,5 μm, medtem ko je bila velikost meristema sadik, vzgojenih na kontrolnem gojišču, ki je vsebovalo DMSO, 264,7 ± 30,8 μm (slika 4c, d), kar kaže, da KAND-11 obnavlja celično aktivnost. širjenje. Koreninski meristem. V skladu s tem je obdelava s KAND 11 zmanjšala količino signala markerja celične delitve CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS v koreninskem meristemu (slika 4e) 17. Ti rezultati kažejo, da KAND 11 zavira rast korenin z zmanjšanjem aktivnosti celične proliferacije.
Analiza zaviralnega učinka derivatov urbenonske kisline (urbeniloksi derivatov) na rast. (a) 7 dni stare sadike divjega tipa Col, gojene na MS ploščah z navedenimi koncentracijami KAND 11. Merilo = 1 cm. (b) Kvantifikacija dolžine korenin. Črke označujejo pomembne razlike (Tukeyjev HSD test, p< 0,05). n>16. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD. (c) Konfokalna mikroskopija s propidijevim jodidom obarvanih korenin divjega tipa Col, vzgojenih na MS ploščah z ali brez 25 μM KAND 11. Beli oklepaji označujejo koreninski meristem. Merilna lestvica = 100 µm. (d) Kvantifikacija velikosti koreninskega meristema (n = 10 do 11). Statistične razlike so bile določene s t-testom (p< 0,05). Stolpci predstavljajo povprečno velikost meristema. (e) Mikroskopija diferencialnega interferenčnega kontrasta (DIC) koreninskega meristema, ki vsebuje konstrukt CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS obarvano in obarvano na 5 dni starih sadikih, vzgojenih na MS ploščah z ali brez 25 µM KAND testa.
Fitotoksičnost KAND 11 je bila nadalje preizkušena z uporabo druge dvokaličnice, tobaka (Nicotiana tabacum), in glavnega modelnega kopenskega rastlinskega organizma, jetrnika (Marchantia polymorpha). Tako kot v primeru Arabidopsis so tudi sadike tobaka SR-1, gojene na gojišču, ki je vsebovalo 25 μM KAND 11, ustvarile krajše korenine (slika 5a). Poleg tega je 40 od 48 semen kalilo na ploščah, ki so vsebovale 200 μM KAND 11, medtem ko je vseh 48 semen kalilo na lažno obdelanih gojiščih, kar kaže na to, da so bile višje koncentracije KAND pomembne (p< 0,05; hi test - kvadrat) je zaviral kalitev tobaka. (slika 5b). Poleg tega je bila koncentracija KAND 11, ki je zavirala rast bakterij v jetrnici, podobna učinkoviti koncentraciji v Arabidopsis (slika 5c). Ti rezultati kažejo, da lahko KAND 11 zavira rast različnih rastlin. Nato smo raziskali možno citotoksičnost spojin, sorodnih medvedjim monoamidom, v drugih organizmih, in sicer v človeških celicah HeLa in sevu Escherichia coli DH5α, kot predstavnikih višjih živalskih oziroma bakterijskih celic. V seriji testov celične proliferacije smo opazili, da kumamonamid 1, kumamonamidna kislina 6 in KAND 11 niso vplivali na rast celic HeLa ali E. coli pri koncentracijah 100 μM (slika 5d,e).
Zaviranje rasti KAND 11 v organizmih, ki niso Arabidopsis. (a) Dva tedna stare sadike tobaka divjega tipa SR-1 so gojili na navpično postavljenih ploščah MS, ki so vsebovale 25 μM KAND 11. (b) Dva tedna stare sadike tobaka divjega tipa SR-1 so gojili na vodoravno postavljenih ploščah MS, ki so vsebovale 200 μM KAND 11. (c) Dva tedna stari popki jetrne trske divjega tipa Tak-1, gojeni na ploščah Gamborg B5 z navedenimi koncentracijami KAND 11. Rdeče puščice označujejo spore, ki so prenehale rasti v dvotedenskem inkubacijskem obdobju. (d) Test proliferacije celic HeLa. Število živih celic je bilo merjeno v določenih časovnih intervalih z uporabo kompleta za štetje celic 8 (Dojindo). Kot kontrola so bile celice HeLa obdelane s 5 μg/ml aktinomicina D (Act D), ki zavira transkripcijo RNA polimeraze in povzroča celično smrt. Analize so bile izvedene v treh ponovitvah. (e) Test proliferacije celic E. coli. Rast E. coli je bila analizirana z merjenjem OD600. Kot kontrolo so bile celice obdelane s 50 μg/ml ampicilina (Amp), ki zavira sintezo bakterijskih celičnih sten. Analize so bile opravljene v treh ponovitvah.
Da bi razvozlali mehanizem delovanja citotoksičnosti, ki jo povzročajo spojine, povezane z uramidom, smo ponovno analizirali derivate urbenske kisline z zmernimi zaviralnimi učinki, kot je prikazano na sliki. Kot je prikazano na slikah 2b in 6a, so sadike, gojene na agar ploščah z visokimi koncentracijami (200 μM) urmotonske kisline 6, ustvarile krajše in levo ukrivljene korenine (θ = –23,7 ± 6,1), medtem ko so sadike, gojene na kontrolnem gojišču, ustvarile skoraj ravne korenine (θ = –3,8 ± 7,1). Znano je, da je ta značilna poševna rast posledica disfunkcije kortikalnih mikrotubulov14,18. V skladu s to ugotovitvijo sta zdravili, ki destabilizirata mikrotubule, dizopiramid in orizalin, v naših rastnih pogojih povzročili podoben nagib korenin (sliki 2b in 6a). Hkrati smo testirali derivate urmotonske kisline in izbrali več teh, ki so pri določenih koncentracijah povzročili poševno rast korenin. Spojine 8, 9 in 15 so spremenile smer rasti korenin pri 75 μM, 50 μM oziroma 40 μM, kar kaže, da lahko te spojine učinkovito destabilizirajo mikrotubule (slika 2b, 6a). Testirali smo tudi najmočnejši derivat ursolne kisline, KAND 11, pri nižji koncentraciji (15 µM) in ugotovili, da je uporaba KAND 11 zavirala rast korenin in da je bila smer rasti korenin neenakomerna, čeprav so se nagibale k levi (slika C3). Ker višje koncentracije zdravil, ki destabilizirajo mikrotubule, včasih zavirajo rast rastlin in ne povzročajo nagibanja korenin, smo nato ocenili možnost, da KAND 11 vpliva na mikrotubule, tako da smo opazovali kortikalne mikrotubule v epidermalnih celicah korenin. Imunohistokemija z uporabo protiteles proti β-tubulinu v epidermalnih celicah korenin sadik, obdelanih s 25 μM KAND 11, je pokazala izginotje skoraj vseh kortikalnih mikrotubulov v epidermalnih celicah v območju podolgovanja (slika 6b). Ti rezultati kažejo, da kumamotonska kislina in njeni derivati delujejo neposredno ali posredno na mikrotubule, da jih porušijo, in da so te spojine novi zaviralci mikrotubulov.
Ursonska kislina in njeni derivati spreminjajo kortikalne mikrotubule pri Arabidopsis thaliana. (a) Kot naklona korenine, izmerjen v prisotnosti različnih derivatov urmotonske kisline pri navedenih koncentracijah. Analizirani so bili tudi učinki dveh spojin, za katere je znano, da zavirajo mikrotubule: dizopiramida in orizalina. Vstavek prikazuje standard, uporabljen za merjenje kota rasti korenin. Zvezdice označujejo pomembne razlike pri navidezni obdelavi (t-test, p< 0,05). n>19. Merilna lestvica = 1 cm. (b) Kortikalne mikrotubule v epidermalnih celicah v coni podolgovanja. Mikrotubule v koreninah divjega tipa Arabidopsis Col, gojenih na ploščah MS z ali brez 25 μM KAND 11, smo vizualizirali z imunohistokemičnim barvanjem z uporabo primarnih protiteles proti β-tubulinu in sekundarnih protiteles, konjugiranih z Alexa Fluor. Merilna lestvica = 10 µm. (c) Mitotična struktura mikrotubulov v koreninskem meristemu. Mikrotubule smo vizualizirali z imunohistokemičnim barvanjem. Mitotične strukture, vključno s profaznimi conami, vretenoma in fragmoplasti, smo prešteli iz konfokalnih slik. Puščice označujejo mitotične strukture mikrotubulov. Zvezdice označujejo pomembne razlike v primerjavi s placebom (t-test, p< 0,05). n>9. Merilna črta = 50 µm.
Čeprav ima Ursa sposobnost motenja delovanja mikrotubulov, se pričakuje, da se njen mehanizem delovanja razlikuje od tipičnih depolimerizirajočih sredstev za mikrotubule. Na primer, višje koncentracije depolimerizirajočih sredstev za mikrotubule, kot sta dizopiramid in orizalin, povzročijo anizotropno ekspanzijo epidermalnih celic, medtem ko KAND 11 tega ne stori. Poleg tega je sočasna uporaba KAND 11 in dizopiramida povzročila kombiniran odziv rasti korenin, ki ga je povzročil dizopiramid, in opazili smo zaviranje rasti, ki ga je povzročil KAND 11 (slika S4). Analizirali smo tudi odziv preobčutljivega mutanta dizopiramid 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 ima nekanonično točkovno mutacijo tubulin kinaze in pri obdelavi z dizopiramidom ustvari krajše korenine9,20. Sadike mutanta phs1-1, gojene na agarskem gojišču, ki je vsebovalo KAND 11, so imele krajše korenine, podobne tistim, ki so gojene na dizopiramidu (slika S5).
Poleg tega smo v koreninskem meristemu sadik, tretiranih s KAND 11, opazovali mitotične strukture mikrotubulov, kot so profazne cone, vretena in fragmoplasti. V skladu z opažanji za CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS smo opazili znatno zmanjšanje števila mitotičnih mikrotubulov (slika .6c).
Za karakterizacijo citotoksičnosti KAND 11 pri subcelični ločljivosti smo suspenzijske celice tobaka BY-2 obdelali s KAND 11 in opazovali njihov odziv. Najprej smo dodali KAND 11 celicam BY-2, ki izražajo TagRFP-TUA6, ki fluorescentno označuje mikrotubule, da bi ocenili učinek KAND 11 na kortikalne mikrotubule. Gostoto kortikalnih mikrotubulov smo ocenili z analizo slike, ki je kvantificirala odstotek citoskeletnih slikovnih pik med citoplazemskimi slikovnimi pikami. Rezultati testa so pokazali, da se je po 1-urni obdelavi s 50 μM ali 100 μM KAND 11 gostota znatno zmanjšala na 0,94 ± 0,74 % oziroma 0,23 ± 0,28 %, medtem ko je gostota celic, obdelanih z DMSO, znašala 1,61 ± 0,34 % (slika 7a). Ti rezultati so skladni z opažanjem pri Arabidopsis, da obdelava s KAND 11 povzroči depolimerizacijo kortikalnih mikrotubulov (slika 6b). Preučili smo tudi linijo BY-2 z aktinskimi filamenti, označenimi z GFP-ABD, po obdelavi z enako koncentracijo KAND 11 in opazili, da je obdelava s KAND 11 porušila aktine filamente. Obdelava s 50 μM ali 100 μM KAND 11 1 uro je znatno zmanjšala gostoto aktinskih filamentov na 1,20 ± 0,62 % oziroma 0,61 ± 0,26 %, medtem ko je bila gostota v celicah, obdelanih z DMSO, 1,69 ± 0,51 % (slika 2). 7b). Ti rezultati so v nasprotju z učinki propizmadida, ki ne vpliva na aktinske filamente, in latrunkulina B, depolimerizatorja aktina, ki ne vpliva na mikrotubule (slika SI S6). Poleg tega obdelava s kumamonamidom 1, kumamonamidno kislino 6 ali KAND 11 ni vplivala na mikrotubule v celicah HeLa (slika SI S7). Zato naj bi se mehanizem delovanja KAND 11 razlikoval od mehanizma delovanja znanih motilcev citoskeleta. Poleg tega je naše mikroskopsko opazovanje celic BY-2, zdravljenih s KAND 11, razkrilo začetek celične smrti med zdravljenjem s KAND 11 in pokazalo, da se delež mrtvih celic, obarvanih z Evansovim modrim, po 30 minutah zdravljenja s KAND 11 ni bistveno povečal, medtem ko se je po 90 minutah zdravljenja s 50 μM ali 100 μM KAND število mrtvih celic povečalo na 43,7 % oziroma 80,1 % (slika 7c). Ti podatki skupaj kažejo, da je novi derivat ursolne kisline KAND 11 rastlinski specifičen zaviralec citoskeleta s prej neznanim mehanizmom delovanja.
KAND vpliva na kortikalne mikrotubule, aktinske filamente in sposobnost preživetja tobačnih celic BY-2. (a) Vizualizacija kortikalnih mikrotubulov v celicah BY-2 v prisotnosti TagRFP-TUA6. Celice BY-2, obdelane s KAND 11 (50 μM ali 100 μM) ali DMSO, so bile pregledane s konfokalno mikroskopijo. Gostota kortikalnih mikrotubulov je bila izračunana iz mikrografij 25 neodvisnih celic. Črke označujejo pomembne razlike (Tukeyjev HSD test, p< 0,05). Merilna črta = 10 µm. (b) Kortikalni aktinski filamenti v celicah BY-2, vizualizirani v prisotnosti GFP-ABD2. Celice BY-2, obdelane s KAND 11 (50 μM ali 100 μM) ali DMSO, so bile pregledane s konfokalno mikroskopijo. Gostota kortikalnih aktinskih filamentov je bila izračunana iz mikrografij 25 neodvisnih celic. Črke označujejo pomembne razlike (Tukeyjev HSD test, p< 0,05). Merilna lestvica = 10 µm. (c) Opazovanje mrtvih celic BY-2 z barvanjem z Evansovim modrim. Celice BY-2, obdelane s KAND 11 (50 μM ali 100 μM) ali DMSO, so bile pregledane s svetlopolno mikroskopijo. n=3. Merilna lestvica = 100 µm.
Odkritje in uporaba novih naravnih produktov je privedlo do pomembnega napredka na različnih področjih človeškega življenja, vključno z medicino in kmetijstvom. Izvedene so bile zgodovinske raziskave za pridobivanje uporabnih spojin iz naravnih virov. Zlasti aktinomiceti so znani kot uporabni antiparazitski antibiotiki za ogorčice zaradi svoje sposobnosti proizvajanja različnih sekundarnih metabolitov, kot sta avermektin, vodilna spojina ivermektina, in bleomicin ter njegovi derivati, ki se v medicini uporabljajo kot sredstvo proti raku21,22. Prav tako so iz aktinomicet odkrili različne herbicidne spojine, od katerih se nekatere že komercialno uporabljajo1,23. Zato se analiza metabolitov aktinomicet za izolacijo naravnih produktov z želenimi biološkimi aktivnostmi šteje za učinkovito strategijo. V tej študiji smo odkrili novo spojino, kumamonamid, iz S. werraensis in jo uspešno sintetizirali. Ursonska kislina je sintetični intermediat urbenamida in njegovih derivatov. Lahko povzroči značilno zvijanje korenin, kaže zmerno do močno herbicidno aktivnost in neposredno ali posredno poškoduje rastlinske mikrotubule. Vendar pa se mehanizem delovanja urmotonske kisline lahko razlikuje od mehanizma delovanja obstoječih zaviralcev mikrotubulov, saj KAND 11 prav tako moti aktinske filamente in povzroča celično smrt, kar kaže na regulativni mehanizem, s katerim urmotonska kislina in njeni derivati vplivajo na širok spekter citoskeletnih struktur.
Nadaljnja podrobna karakterizacija urbenonske kisline bo pripomogla k boljšemu razumevanju mehanizma delovanja urbenonske kisline. Naslednji cilj je zlasti oceniti sposobnost ursonske kisline, da se veže na reducirane mikrotubule, da bi ugotovili, ali ursonska kislina in njeni derivati delujejo neposredno na mikrotubule in jih depolimerizirajo ali pa njihovo delovanje povzroči destabilizacijo mikrotubulov. Poleg tega bo v primeru, ko mikrotubule niso neposredna tarča, identifikacija mesta delovanja in molekularnih tarč ursonske kisline na rastlinskih celicah pomagala bolje razumeti lastnosti sorodnih spojin in možne načine za izboljšanje herbicidne aktivnosti. Naš test bioaktivnosti je pokazal edinstveno citotoksično sposobnost ursonske kisline na rast rastlin, kot so Arabidopsis thaliana, tobak in jetrnik, medtem ko niti celice E. coli niti celice HeLa niso bile prizadete. Majhna ali nična toksičnost za živalske celice je prednost derivatov ursonske kisline, če so razviti kot herbicidi za uporabo na odprtih kmetijskih poljih. Ker so mikrotubule pogoste strukture pri evkariontih, je njihova selektivna inhibicija v rastlinah ključna zahteva za herbicide. Na primer, propizamid, sredstvo za depolimerizacijo mikrotubulov, ki se neposredno veže na tubulin in zavira polimerizacijo, se zaradi nizke toksičnosti za živalske celice uporablja kot herbicid24. V nasprotju z dizopiramidom imajo sorodni benzamidi drugačno ciljno specifičnost. Poleg rastlinskih mikrotubulov RH-4032 oziroma benzoksamid zavira tudi mikrotubule živalskih celic oziroma oomicetov, zalilamid pa se zaradi nizke fitotoksičnosti uporablja kot fungicid25,26,27. Novo odkriti medved in njegovi derivati kažejo selektivno citotoksičnost proti rastlinam, vendar je treba omeniti, da lahko nadaljnje modifikacije spremenijo njihovo ciljno specifičnost, kar lahko zagotovi dodatne derivate za nadzor patogenih gliv ali oomicetov.
Edinstvene lastnosti urbenonske kisline in njenih derivatov so uporabne za njihov razvoj kot herbicidov in uporabo kot raziskovalnih orodij. Pomen citoskeleta pri nadzoru oblike rastlinskih celic je splošno priznan. Prejšnje študije so pokazale, da so rastline razvile kompleksne mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubulov z nadzorom dinamike mikrotubulov za pravilen nadzor morfogeneze. Identificiranih je bilo veliko število molekul, odgovornih za regulacijo aktivnosti mikrotubulov, in sorodne raziskave še vedno potekajo3,4,28. Naše trenutno razumevanje dinamike mikrotubulov v rastlinskih celicah ne pojasnjuje v celoti mehanizmov organizacije kortikalnih mikrotubulov. Na primer, čeprav lahko tako dizopiramid kot orizalin depolimerizirata mikrotubule, dizopiramid povzroča hudo popačenje korenin, medtem ko ima orizalin relativno blag učinek. Poleg tega mutacije v tubulinu, ki stabilizira mikrotubule, povzročajo tudi dekstrorotacijo v koreninah, medtem ko paklitaksel, ki prav tako stabilizira dinamiko mikrotubulov, tega ne počne. Zato bi moralo preučevanje in identifikacija molekularnih tarč ursolne kisline zagotoviti nove vpoglede v regulacijo rastlinskih kortikalnih mikrotubulov. Prav tako bodo prihodnje primerjave kemikalij, ki učinkovito spodbujajo popačeno rast, kot je dizopiramid, in manj učinkovitih kemikalij, kot sta orizalin ali kumamotorna kislina, dale namige o tem, kako pride do popačene rasti.
Po drugi strani pa so obrambno povezane preureditve citoskeleta še ena možnost za razlago citotoksičnosti ursonske kisline. Okužba s patogenom ali vnos elicitorja v rastlinske celice včasih povzroči uničenje citoskeleta in posledično celično smrt29. Na primer, poročali so, da kriptoksantin, pridobljen iz oomicetov, moti mikrotubule in aktinske filamente pred smrtjo tobačnih celic, podobno kot se zgodi pri zdravljenju s KAND30,31. Podobnosti med obrambnimi odzivi in celičnimi odzivi, ki jih povzroča ursonska kislina, so nas pripeljale do hipoteze, da sprožijo skupne celične procese, čeprav je očiten hitrejši in močnejši učinek ursonske kisline kot kriptoksantina. Vendar pa so študije pokazale, da motenje aktinskih filamentov spodbuja spontano celično smrt, ki je ne spremlja vedno motenje mikrotubulov29. Poleg tega je treba še videti, ali patogen ali elicitor povzroča popačeno rast korenin, kot to počnejo derivati ursonske kisline. Zato je molekularno znanje, ki povezuje obrambne odzive in citoskelet, privlačen problem, ki ga je treba obravnavati. Z izkoriščanjem prisotnosti nizkomolekularnih spojin, sorodnih ursonski kislini, kot tudi vrste derivatov z različnimi potencami, lahko ponudijo priložnosti za ciljanje neznanih celičnih mehanizmov.
Odkritje in uporaba novih spojin, ki modulirajo dinamiko mikrotubulov, bosta skupaj zagotovila močne metode za obravnavo kompleksnih molekularnih mehanizmov, ki so podlaga za določanje oblike rastlinskih celic. V tem kontekstu bi lahko nedavno razvita spojina urmotonska kislina, ki vpliva na mikrotubule in aktinske filamente ter povzroča celično smrt, ponudila priložnost za razvozlavanje povezave med nadzorom mikrotubulov in temi drugimi mehanizmi. Tako nam bo kemijska in biološka analiza z uporabo urbenonske kisline pomagala razumeti molekularne regulativne mehanizme, ki nadzorujejo rastlinski citoskelet.
S. werraensis MK493-CF1 inokulirajte v 500 ml erlenmajerjevo bučko z zapornico, ki vsebuje 110 ml gojišča za semena, ki ga sestavljajo 2 % (m/v) galaktoze, 2 % (m/v) esenčne paste, 1 % (m/v) Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (m/v) koruznega ekstrakta (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonska), 0,2 % (m/v) (NH4)2SO4 in 0,2 % CaCO3 v deionizirani vodi (pH 7,4 pred sterilizacijo). Semenske kulture smo inkubirali na rotacijskem stresalniku (180 vrt/min) pri 27 °C 2 dni. Proizvodna gojitev s fermentacijo v trdnem stanju. Semensko kulturo (7 ml) smo prenesli v 500 ml bučko K-1, ki je vsebovala 40 g produkcijskega medija, ki je vseboval 15 g stisnjenega ječmena (MUSO Co., Ltd., Japonska) in 25 g deionizirane vode (pH pred sterilizacijo ni bil prilagojen). Fermentacija je potekala pri 30 °C v temi 14 dni. Fermentacijski material smo ekstrahirali s 40 ml/steklenico EtOH in centrifugirali (1500 g, 4 °C, 10 min). Supernatant kulture (60 ml) smo ekstrahirali z mešanico 10 % MeOH/EtOAc. Organsko plast smo uparili pod znižanim tlakom, da smo dobili ostanek (59,5 mg), ki smo ga podvrgli HPLC z gradientno elucijo (0–10 minut: 90 %) na koloni z reverzno fazo (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dolžina 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90 % H2O/CH3CN do 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minut: 90 % H2O/EtOH do 100 % EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100 % EtOH) pri pretoku 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) pa smo izolirali kot bel amorfni prah.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ izračunana vrednost: 141,0659, izmerjena vrednost: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Semena vrste Columbia (Col-0) so bila pridobljena iz Centra za biološke vire Arabidopsis (ABRC) z dovoljenjem za raziskovalno uporabo. Semena Col-0 so bila razmnožena in vzdrževana v naših laboratorijskih pogojih ter uporabljena kot rastline Arabidopsis divjega tipa. Semena Arabidopsis so bila površinsko sterilizirana in gojena v gojišču Murashige in Skoog s polovično koncentracijo, ki je vsebovalo 2 % saharoze (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (m/v) 2-(4-morfolino)etansulfonske kisline (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). in 1,5 % agarja (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pri 23 °C in stalni svetlobi. Semena mutanta phs1-1 je zagotovil T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Semena seva SR-1 je zagotovil T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) in so bila uporabljena kot rastline tobaka divjega tipa. Semena tobaka so bila površinsko sterilizirana in tri noči namočena v sterilni vodi, da bi spodbudili kalitev, nato pa so bila postavljena v polovično koncentrirano raztopino, ki je vsebovala 2 % saharoze, 0,05 % (m/v) MES in 0,8 % gelan gumija (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige in Skoog gojišče) s pH 5,7 in inkubirana pri 23 °C pod stalno svetlobo.
Sev Tak-1 je zagotovil T. Kohchi (Univerza v Kjotu) in je bil uporabljen kot standardna eksperimentalna enota za študijo jetrnikov. Gemma je bila pridobljena iz steriliziranih gojenih rastlin in nato posejana na gojišče Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), ki je vsebovalo 1 % saharoze in 0,3 % gelan gumija, ter inkubirana pri 23 °C pod stalno svetlobo.
Celice tobaka BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) je zagotovil S. Hasezawa (Univerza v Tokiu). Celice BY-2 so bile 95-krat razredčene v modificiranem mediju Linsmeierja in Skooga ter tedensko dopolnjene z 2,4-diklorofenoksiocetno kislino 32. Celično suspenzijo so mešali na rotacijskem stresalniku pri 130 vrt/min pri 27 °C v temi. Celice smo sprali z 10-kratno prostornino svežega medija in jih resuspendirali v istem mediju. Transgene celične linije BY-2, ki stabilno izražajo označevalec mikrotubulov TagRFP-TUA6 ali označevalec aktinskih filamentov GFP-ABD2 pod promotorjem 35S virusa mozaika cvetače, smo ustvarili, kot je opisano 33, 34, 35. Te celične linije je mogoče vzdrževati in sinhronizirati z uporabo postopkov, podobnih tistim, ki so bili uporabljeni za originalno celično linijo BY-2.
Celice HeLa smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM) (Life Technologies), dopolnjenem z 10 % fetalnim govejim serumom, 1,2 U/ml penicilina in 1,2 μg/ml streptomicina, v inkubatorju pri 37 °C s 5 % CO2.
Vsi poskusi, opisani v tem rokopisu, so bili izvedeni v skladu z japonskimi predpisi in smernicami o biološki varnosti.
Spojine so bile raztopljene v dimetil sulfoksidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kot osnovne raztopine in razredčene v MS gojišču za Arabidopsis in tobak ali Gamborg B5 gojišču za jetrno moko. Za test zaviranja rasti korenin je bilo več kot 10 semen na ploščo posejanih na agar gojišče, ki je vsebovalo navedene spojine ali DMSO. Semena so bila 7 dni inkubirana v rastni komori. Sadike so bile fotografirane in izmerjena je bila dolžina korenin. Za test kalivosti Arabidopsis je bilo 48 semen na ploščo posejanih na agar gojišče, ki je vsebovalo 200 μM spojine ali DMSO. Semena Arabidopsis so bila gojena v rastni komori in število kaljenih sadik je bilo prešteto 7 dni po kalitvi (dag). Za test kalivosti tobaka je bilo 24 semen na ploščo posejanih na agar gojišče, ki je vsebovalo 200 μM KAND ali DMSO. Semena tobaka so bila gojena v rastni komori in število kaljenih sadik je bilo prešteto po 14 dneh. Za test zaviranja rasti jetrnikov je bilo 9 zarodkov iz vsake plošče nasajenih na agarni medij, ki je vseboval navedene koncentracije KAND ali DMSO, in inkubiranih v rastni komori 14 dni.
Za vizualizacijo organizacije koreninskih meristemov smo uporabili sadike, obarvane s 5 mg/ml propidijevega jodida (PI). Signale PI smo opazovali s fluorescenčno mikroskopijo z uporabo konfokalnega laserskega skenirnega mikroskopa TCS SPE (Leica Microsystems).
Histokemično barvanje korenin z β-glukuronidazo (GUS) je bilo izvedeno po protokolu, ki sta ga opisala Malami in Benfey36. Sadike so bile čez noč fiksirane v 90 % acetonu, 1 uro obarvane z 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronske kisline v GUS pufru in nato postavljene v hidrirano raztopino kloraldehida (8 g kloral hidrata, 2 ml vode in 1 ml glicerola) ter opazovane z diferencialno interferenčno kontrastno mikroskopijo z mikroskopom Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Koreninski koti so bili izmerjeni na 7 dni starih sadikah, vzgojenih na navpično postavljenih ploščah. Izmerite kot korenine glede na smer vektorja gravitacije, kot je opisano v 6. koraku.
Razporeditev kortikalnih mikrotubulov je bila opazovana, kot je opisano, z manjšimi spremembami protokola 37. Kot primarna in sekundarna protitelesa sta bila uporabljena protitelesa proti β-tubulinu (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) in z Alexa Fluor 488 konjugirana protitelesa proti mišjemu IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) v razredčenju 1:1000 oziroma 1:100. Fluorescenčne slike so bile pridobljene z uporabo konfokalnega laserskega skenirnega mikroskopa TCS SPE (Leica Microsystems). Pridobite slike Z-stack in ustvarite projekcije največje intenzivnosti v skladu z navodili proizvajalca.
Test proliferacije celic HeLa smo izvedli z uporabo kompleta za štetje celic 8 (Dojindo) v skladu z navodili proizvajalca.
Rast E. coli DH5α smo analizirali z merjenjem gostote celic v kulturi s spektrofotometrom pri 600 nm (OD600).
Organizacijo citoskeleta v transgenih celicah BY-2 smo opazovali z uporabo fluorescentnega mikroskopa, opremljenega s konfokalno skenirno napravo CSU-X1 (Yokogawa) in sCMOS kamero (Zyla, Andor Technology). Gostoto citoskeleta smo ocenili z analizo slike, ki je kvantificirala odstotek citoskeletnih slikovnih pik med citoplazemskimi slikovnimi pikami v konfokalnih slikah z uporabo programske opreme ImageJ, kot je opisano38,39.
Za odkrivanje celične smrti v celicah BY-2 smo alikvot celične suspenzije 10 minut inkubirali z 0,05 % Evansovim modrim barvilom pri sobni temperaturi. Selektivno obarvanje odmrlih celic z Evansovim modrim barvilom je odvisno od iztiskanja barvila iz živih celic skozi intaktno plazemsko membrano40. Obarvane celice smo opazovali z mikroskopom s svetlim poljem (BX53, Olympus).
Celice HeLa smo gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 % FBS, v vlažnem inkubatorju pri 37 °C in 5 % CO2. Celice smo 6 ur pri 37 °C obdelali s 100 μM KAND 11, kumamonaminsko kislino 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml kolcemida (Gibco) ali 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma). Celice smo 10 minut fiksirali z MetOH in nato 5 minut z acetatom pri sobni temperaturi. Fiksirane celice smo 2 uri inkubirali s primarnim protitelesom proti β-tubulinu (1D4A4, Proteintech: 66240-1), razredčenim v 0,5 % BSA/PBS, 3-krat sprali s TBST in nato 1 uro inkubirali s kozjim protitelesom Alexa Fluor. 488 – Mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) in 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI), razredčenega v 0,5 % BSA/PBS. Po trikratnem izpiranju s TBST so bile obarvane celice opazovane na inverznem mikroskopu Nikon Eclipse Ti-E. Slike so bile zajete s ohlajeno kamero Hamamatsu ORCA-R2 CCD z uporabo programske opreme MetaMorph (Molecular Devices).
Čas objave: 17. junij 2024