Učinkovitozatiranje komarjevin zmanjšati pojavnost bolezni, ki jih prenašajo, so potrebne strateške, trajnostne in okolju prijazne alternative kemičnim pesticidom. Ocenili smo semensko moko iz nekaterih vrst iz družine Brassicaceae (družina Brassica) kot vir rastlinskih izotiocianatov, proizvedenih z encimsko hidrolizo biološko neaktivnih glukozinolatov, za uporabo pri zatiranju egiptovske strupene mletje (Aedes) (L., 1762). Petkrat razmaščena semenska moka (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 in Thlaspi arvense – tri glavne vrste toplotne inaktivacije in encimske razgradnje). Kemični produkti: Za določitev toksičnosti (LC50) alil izotiocianata, benzil izotiocianata in 4-hidroksibenzilizotiocianata za ličinke strupene mletje (Aedes aegypti) pri 24-urni izpostavljenosti = 0,04 g/120 ml dH2O). Vrednosti LC50 za gorčično, belo gorčično in preslično moko so bile 0,05, 0,08 oziroma 0,05 v primerjavi z alil izotiocianatom (LC50 = 19,35 ppm) in 4,2-hidroksibenzilizotiocianat (LC50 = 55,41 ppm) je bil 24 ur po tretiranju bolj strupen za ličinke kot 0,1 g/120 ml dH2O. Ti rezultati so skladni s proizvodnjo moke iz semen lucerne. Višja učinkovitost benzil estrov ustreza izračunanim vrednostim LC50. Uporaba moke iz semen lahko zagotovi učinkovito metodo zatiranja komarjev. To prikazuje učinkovitost prahu križnic in njegovih glavnih kemičnih sestavin proti ličinkam komarjev ter kaže, kako lahko naravne spojine v prahu križnic služijo kot obetaven okolju prijazen larvicid za zatiranje komarjev.
Vektorske bolezni, ki jih povzročajo komarji Aedes, ostajajo velik svetovni javnozdravstveni problem. Pojavnost bolezni, ki jih prenašajo komarji, se geografsko širi1,2,3 in ponovno pojavlja, kar vodi do izbruhov hudih bolezni4,5,6,7. Širjenje bolezni med ljudmi in živalmi (npr. čikungunja, denga, mrzlica doline Rift, rumena mrzlica in virus Zika) je brez primere. Samo zaradi mrzlice denga je v tropih približno 3,6 milijarde ljudi okuženih, letno pa se ocenjuje, da se okuži 390 milijonov ljudi, kar povzroči 6.100–24.300 smrti na leto8. Ponovni pojav in izbruh virusa Zika v Južni Ameriki sta pritegnila pozornost sveta zaradi poškodb možganov, ki jih povzroča pri otrocih, rojenih okuženim ženskam2. Kremer in sodelavci3 napovedujejo, da se bo geografsko območje razširjenosti komarjev Aedes še naprej širilo in da bo do leta 2050 polovica svetovnega prebivalstva ogrožena zaradi okužbe z arbovirusi, ki jih prenašajo komarji.
Z izjemo nedavno razvitih cepiv proti dengi in rumeni mrzlici cepiva proti večini bolezni, ki jih prenašajo komarji, še niso bila razvita9,10,11. Cepiva so še vedno na voljo v omejenih količinah in se uporabljajo le v kliničnih preskušanjih. Zatiranje prenašalcev komarjev z uporabo sintetičnih insekticidov je bila ključna strategija za nadzor širjenja bolezni, ki jih prenašajo komarji12,13. Čeprav so sintetični pesticidi učinkoviti pri uničevanju komarjev, nadaljnja uporaba sintetičnih pesticidov negativno vpliva na neciljne organizme in onesnažuje okolje14,15,16. Še bolj zaskrbljujoč je trend naraščajoče odpornosti komarjev na kemične insekticide17,18,19. Te težave, povezane s pesticidi, so pospešile iskanje učinkovitih in okolju prijaznih alternativ za nadzor prenašalcev bolezni.
Različne rastline so bile razvite kot viri fitopesticidov za zatiranje škodljivcev20,21. Rastlinske snovi so na splošno okolju prijazne, ker so biorazgradljive in imajo nizko ali zanemarljivo toksičnost za neciljne organizme, kot so sesalci, ribe in dvoživke20,22. Znano je, da zeliščni pripravki proizvajajo različne bioaktivne spojine z različnimi mehanizmi delovanja za učinkovito zatiranje različnih življenjskih faz komarjev23,24,25,26. Spojine rastlinskega izvora, kot so eterična olja in druge aktivne rastlinske sestavine, so pritegnile pozornost in utrle pot inovativnim orodjem za zatiranje prenašalcev komarjev. Eterična olja, monoterpeni in seskviterpeni delujejo kot repelenti, odvračilna sredstva proti hranjenju in ovicidi27,28,29,30,31,32,33. Številna rastlinska olja povzročajo smrt ličink, bub in odraslih komarjev34,35,36, kar vpliva na živčni, dihalni, endokrini in druge pomembne sisteme žuželk37.
Nedavne študije so ponudile vpogled v potencialno uporabo gorčičnih rastlin in njihovih semen kot vira bioaktivnih spojin. Gorčična moka je bila preizkušena kot biofumigant38,39,40,41 in uporabljena kot dodatek k tlom za zatiranje plevela42,43,44 in nadzor nad rastlinskimi patogeni, ki se prenašajo v tleh45,46,47,48,49,50, prehrano rastlin, ogorčic 41,51, 52, 53, 54 in škodljivcev 55, 56, 57, 58, 59, 60. Fungicidno delovanje teh semenskih praškov pripisujejo rastlinskim zaščitnim spojinam, imenovanim izotiocianati38,42,60. V rastlinah so te zaščitne spojine shranjene v rastlinskih celicah v obliki nebioaktivnih glukozinolatov. Ko pa rastline poškoduje hranjenje z žuželkami ali okužba s patogeni, glukozinolate mirozinaza hidrolizira v bioaktivne izotiocianate55,61. Izotiocianati so hlapne spojine, za katere je znano, da imajo širok spekter protimikrobnega in insekticidnega delovanja, njihova struktura, biološka aktivnost in vsebnost pa se med vrstami Brassicaceae zelo razlikujejo42,59,62,63.
Čeprav je znano, da imajo izotiocianati, pridobljeni iz gorčične moke, insekticidno delovanje, podatki o biološki aktivnosti proti medicinsko pomembnim členonožnim vektorjem primanjkujejo. Naša študija je preučevala larvicidno aktivnost štirih razmaščenih semenskih praškov proti komarjem Aedes. Ličinke Aedes aegypti. Cilj študije je bil oceniti njihovo potencialno uporabo kot okolju prijaznih biopesticidov za zatiranje komarjev. Za preizkus biološke aktivnosti teh kemičnih komponent na ličinke komarjev so bile testirane tudi tri glavne kemične komponente semenske moke, alil izotiocianat (AITC), benzil izotiocianat (BITC) in 4-hidroksibenzilizotiocianat (4-HBITC). To je prvo poročilo, ki ocenjuje učinkovitost štirih praškov iz semen zelja in njihovih glavnih kemičnih komponent proti ličinkam komarjev.
Laboratorijske kolonije Aedes aegypti (sev Rockefeller) so vzdrževali pri 26 °C, 70 % relativni vlažnosti (RH) in 10:14 h (fotoperioda L:D). Parjene samice so bile nameščene v plastičnih kletkah (višina 11 cm in premer 9,5 cm) in hranjene prek sistema za hranjenje s stekleničko s citratno govejo krvjo (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, ZDA). Hranjenje s krvjo je potekalo kot običajno z uporabo membranskega večsteklenega podajalnika (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, ZDA), povezanega s cevjo za kroženje vodne kopeli (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, ZDA) s temperaturnim nadzorom 37 °C. Na dno vsake steklene komore za hranjenje (površina 154 mm2) je bila nanesena folija Parafilm M. Vsak podajalnik je bil nato nameščen na zgornjo mrežo, ki je pokrivala kletko s parječo se samico. V stekleni lijak za podajanje s Pasteurjevo pipeto (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) smo dodali približno 350–400 μl goveje krvi in pustili, da se odcedijo vsaj eno uro. Breje samice so nato prejele 10-odstotno raztopino saharoze in jim pustile odležati jajčeca na vlažnem filtrirnem papirju, obloženem v posameznih ultra prozornih skodelicah za sufle (velikosti 1,25 tekoče unče, Dart Container Corp., Mason, MI, ZDA). V kletko smo napolnili z vodo. Filtrirni papir z jajčeci smo dali v zaprto vrečko (SC Johnsons, Racine, WI) in shranili pri 26 °C. Jajčeca so se izlegla in približno 200–250 ličink smo vzgojili v plastičnih pladnjih, ki so vsebovali mešanico kunčje hrane (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, ZDA) in jetrnega prahu (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, ZDA) ter ribjega fileja (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Nemčija) v razmerju 2:1:1. V naših bioloških testih smo uporabili ličinke poznega tretjega stadija.
Semenski material rastlin, uporabljen v tej študiji, je bil pridobljen iz naslednjih komercialnih in vladnih virov: Brassica juncea (rjava gorčica - Pacific Gold) in Brassica juncea (bela gorčica - Ida Gold) od Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Washington State, ZDA; (vrtna kreša) od Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, ZDA in Thlaspi arvense (poljska kreša - Elisabeth) od USDA-ARS, Peoria, IL, ZDA; Nobeno od semen, uporabljenih v študiji, ni bilo tretirano s pesticidi. Ves semenski material je bil v tej študiji predelan in uporabljen v skladu z lokalnimi in nacionalnimi predpisi ter v skladu z vsemi ustreznimi lokalnimi, državnimi in nacionalnimi predpisi. Ta študija ni preučevala transgenih sort rastlin.
Semena Brassica juncea (PG), lucerne (Ls), bele gorčice (IG) in Thlaspi arvense (DFP) so bila zmleta v fin prah z ultracentrifugalnim mlinom Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Nemčija), opremljenim z 0,75 mm odprtino in rotorjem iz nerjavečega jekla, 12 zobmi, 10.000 vrt/min (tabela 1). Prašek zmletih semen je bil prenesen v papirnato posodo in razmaščen s heksanom v Soxhletovem aparatu 24 ur. Podvzorec razmaščene poljske gorčice je bil toplotno obdelan pri 100 °C 1 uro, da se denaturira mirozinaza in prepreči hidroliza glukozinolatov, ki tvorijo biološko aktivne izotiocianate. Toplotno obdelan prah semen preslice (DFP-HT) je bil uporabljen kot negativna kontrola z denaturacijo mirozinaze.
Vsebnost glukozinolatov v razmaščenem semenskem prahu je bila določena v treh izvodih z visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC) v skladu s predhodno objavljenim protokolom 64. Na kratko, 250 mg vzorcu razmaščenega semenskega prahu so dodali 3 ml metanola. Vsak vzorec je bil 30 minut sonificiran v vodni kopeli in nato 16 ur v temi pri 23 °C. 1 ml alikvota organske plasti je bila nato filtrirana skozi 0,45 μm filter v avtovzorčevalnik. Z uporabo sistema Shimadzu HPLC (dve črpalki LC 20AD; avtovzorčevalnik SIL 20A; razplinjevalec DGU 20A; UV-VIS detektor SPD-20A za spremljanje pri 237 nm; in komunikacijski modul vodila CBM-20A) je bila vsebnost glukozinolatov v semenskem prahu določena v treh izvodih z uporabo programske opreme Shimadzu LC Solution različice 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, ZDA). Kolona je bila kolona C18 Inertsil z reverzno fazo (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, ZDA). Začetni pogoji mobilne faze so bili nastavljeni na 12 % metanola/88 % 0,01 M tetrabutilamonijevega hidroksida v vodi (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) s pretokom 1 ml/min. Po injiciranju 15 μl vzorca so bili začetni pogoji vzdrževani 20 minut, nato pa je bilo razmerje topil prilagojeno na 100 % metanola, s skupnim časom analize vzorca 65 minut. Standardna krivulja (na osnovi nM/mAb) je bila ustvarjena s serijskimi razredčitvami sveže pripravljenih standardov sinapina, glukozinolata in mirozina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) za oceno vsebnosti žvepla v razmaščenem semenskem zdrobu. Koncentracije glukozinolatov v vzorcih so bile preizkušene na HPLC-sistemu Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, ZDA) z uporabo programa OpenLAB CDS ChemStation različice (C.01.07 SR2 [255]), opremljenega z isto kolono, in z uporabo predhodno opisane metode. Koncentracije glukozinolatov so bile določene tako, da so bile primerljive med sistemi HPLC.
Alil izotiocianat (94 %, stabilen) in benzil izotiocianat (98 %) sta bila kupljena pri podjetju Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). 4-hidroksibenzilizotiocianat je bil kupljen pri podjetju ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, ZDA). Ko jih mirozinaza encimsko hidrolizira, glukozinolati in glukozinolati tvorijo alil izotiocianat, benzil izotiocianat oziroma 4-hidroksibenzilizotiocianat.
Laboratorijski biološki testi so bili izvedeni po metodi Muturija in sod.32 z modifikacijami. V študiji je bilo uporabljenih pet semenskih krm z nizko vsebnostjo maščob: DFP, DFP-HT, IG, PG in Ls. Dvajset ličink je bilo nameščenih v 400 ml čašo za enkratno uporabo s tremi stebri (VWR International, LLC, Radnor, PA, ZDA), ki je vsebovala 120 ml deionizirane vode (dH2O). Sedem koncentracij semenske moke je bilo testiranih na toksičnost za ličinke komarjev: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 in 0,12 g semenske moke/120 ml dH2O za semensko moko DFP, DFP-HT, IG in PG. Predhodni biološki testi kažejo, da je razmaščena semenska moka Ls bolj strupena kot štiri druge testirane semenske moke. Zato smo sedem koncentracij semenske moke Ls prilagodili na naslednje koncentracije: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 in 0,075 g/120 mL dH2O.
Za oceno normalne umrljivosti žuželk v pogojih preskusa je bila vključena netretirana kontrolna skupina (dH20, brez dodatka semenske moke). Toksikološki biološki testi za vsako semensko moko so vključevali tri ponovljene čaše s tremi nakloni (20 ličink pozne tretje stopnje na čašo), skupaj 108 vial. Tretirane posode so bile shranjene pri sobni temperaturi (20–21 °C), umrljivost ličink pa je bila zabeležena med 24 in 72 urah neprekinjene izpostavljenosti tretiranim koncentracijam. Če se telo in okončine komarja ne premaknejo, ko jih prebodemo ali se jih dotaknemo s tanko lopatico iz nerjavečega jekla, se ličinke komarjev štejejo za mrtve. Mrtve ličinke običajno ostanejo negibne v hrbtnem ali trebušnem položaju na dnu posode ali na površini vode. Poskus so ponovili trikrat na različne dni z različnimi skupinami ličink, skupaj 180 ličink, izpostavljenih vsaki tretirani koncentraciji.
Toksičnost AITC, BITC in 4-HBITC za ličinke komarjev je bila ocenjena z istim postopkom biološkega testa, vendar z različnimi obdelavami. Za vsako kemikalijo pripravite 100.000 ppm osnovne raztopine tako, da v 2-mililitrski centrifugalni epruveti dodate 100 µL kemikalije 900 µL absolutnega etanola in stresate 30 sekund, da se dobro premeša. Koncentracije obdelave so bile določene na podlagi naših predhodnih bioloških testov, ki so pokazali, da je BITC veliko bolj strupen kot AITC in 4-HBITC. Za določitev toksičnosti smo uporabili 5 koncentracij BITC (1, 3, 6, 9 in 12 ppm), 7 koncentracij AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 in 35 ppm) in 6 koncentracij 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 in 35 ppm, 30, 45, 60, 75 in 90 ppm). Kontrolni obdelavi je bilo vbrizganih 108 μL absolutnega etanola, kar je enako največjemu volumnu kemične obdelave. Biološki testi so bili ponovljeni kot zgoraj, pri čemer je bilo izpostavljenih skupno 180 ličink na koncentracijo obdelave. Smrtnost ličink je bila zabeležena za vsako koncentracijo AITC, BITC in 4-HBITC po 24 urah neprekinjene izpostavljenosti.
Probitna analiza 65 podatkov o smrtnosti, povezani z odmerkom, je bila izvedena z uporabo programske opreme Polo (Polo Plus, LeOra Software, različica 1.0) za izračun 50-odstotne smrtne koncentracije (LC50), 90-odstotne smrtne koncentracije (LC90), naklona, koeficienta smrtnega odmerka in 95-odstotne smrtne koncentracije na podlagi intervalov zaupanja za razmerja smrtnih odmerkov za logaritemsko transformirane krivulje koncentracije in krivulje odmerka-smrtnosti. Podatki o smrtnosti temeljijo na kombiniranih ponovljenih podatkih 180 ličink, izpostavljenih vsaki koncentraciji tretiranja. Verjetnostne analize so bile izvedene ločeno za vsako semensko moko in vsako kemično komponento. Na podlagi 95-odstotnega intervala zaupanja razmerja smrtnih odmerkov je bila toksičnost semenske moke in kemičnih sestavin za ličinke komarjev ocenjena kot bistveno drugačna, zato interval zaupanja z vrednostjo 1 ni bil bistveno drugačen, P = 0,0566.
Rezultati HPLC za določanje glavnih glukozinolatov v razmaščenih semenskih mokah DFP, IG, PG in Ls so navedeni v tabeli 1. Glavni glukozinolati v testiranih semenskih mokah so se razlikovali, z izjemo DFP in PG, ki sta obe vsebovali mirozinazne glukozinolate. Vsebnost mirozinina v PG je bila višja kot v DFP, 33,3 ± 1,5 oziroma 26,5 ± 0,9 mg/g. Semenski prah Ls je vseboval 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikona, medtem ko je semenski prah IG vseboval 38,0 ± 0,5 mg/g sinapina.
Ličinke komarjev vrste Ae. Aedes aegypti so bile ubite pri tretiranju z razmaščenim semenskim prahom, čeprav se je učinkovitost tretiranja razlikovala glede na vrsto rastline. Le DFP-NT ni bil strupen za ličinke komarjev po 24 in 72 urah izpostavljenosti (tabela 2). Toksičnost aktivnega semenskega prahu se je povečevala z naraščajočo koncentracijo (slika 1A, B). Toksičnost semenskega prahu za ličinke komarjev se je znatno razlikovala glede na 95-odstotni IZ razmerja smrtnih odmerkov vrednosti LC50 pri 24-urni in 72-urni oceni (tabela 3). Po 24 urah je bil toksični učinek semenskega prahu Ls večji kot pri drugih tretiranjih s semenskim prahom, z najvišjo aktivnostjo in največjo toksičnostjo za ličinke (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Ličinke so bile po 24 urah manj občutljive na DFP v primerjavi z obdelavo s semenskim prahom IG, Ls in PG, z vrednostmi LC50 0,115, 0,04 in 0,08 g/120 ml dH2O, kar je bilo statistično značilno višje od vrednosti LC50 0,211 g/120 ml dH2O (tabela 3). Vrednosti LC90 DFP, IG, PG in Ls so bile 0,376, 0,275, 0,137 in 0,074 g/120 ml dH2O (tabela 2). Najvišja koncentracija DPP je bila 0,12 g/120 ml dH2O. Po 24 urah ocenjevanja je bila povprečna umrljivost ličink le 12 %, medtem ko je povprečna umrljivost ličink IG in PG dosegla 51 % oziroma 82 %. Po 24 urah ocenjevanja je bila povprečna umrljivost ličink pri najvišji koncentraciji semenske moke Ls (0,075 g/120 ml dH2O) 99 % (slika 1A).
Krivulje umrljivosti so bile ocenjene iz odziva na odmerek (Probit) ličink Ae. egiptovske (ličinke 3. instarja) na koncentracijo semenske moke 24 ur (A) in 72 ur (B) po tretiranju. Črtkana črta predstavlja LC50 tretiranja semenske moke. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Toplotno inaktiviran Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Pri 72-urni oceni so bile vrednosti LC50 za semensko moko DFP, IG in PG 0,111, 0,085 oziroma 0,051 g/120 ml dH2O. Skoraj vse ličinke, izpostavljene semenski moki Ls, so poginile po 72 urah izpostavljenosti, zato podatki o umrljivosti niso bili skladni z analizo Probit. V primerjavi z drugimi semenskimi mokami so bile ličinke manj občutljive na tretiranje s semensko moko DFP in so imele statistično višje vrednosti LC50 (preglednici 2 in 3). Po 72 urah so bile vrednosti LC50 za tretiranje s semensko moko DFP, IG in PG ocenjene na 0,111, 0,085 oziroma 0,05 g/120 ml dH2O. Po 72 urah ocene so bile vrednosti LC90 za semenske praške DFP, IG in PG 0,215, 0,254 oziroma 0,138 g/120 ml dH2O. Po 72 urah ocenjevanja je bila povprečna umrljivost ličink pri tretiranju semenske moke DFP, IG in PG pri najvišji koncentraciji 0,12 g/120 ml dH2O 58 %, 66 % oziroma 96 % (slika 1B). Po 72-urnem ocenjevanju se je izkazalo, da je semenska moka PG bolj toksična kot semenska moka IG in DFP.
Sintetični izotiocianati, alil izotiocianat (AITC), benzil izotiocianat (BITC) in 4-hidroksibenzilizotiocianat (4-HBITC) lahko učinkovito ubijejo ličinke komarjev. 24 ur po tretiranju je bil BITC bolj toksičen za ličinke z vrednostjo LC50 5,29 ppm v primerjavi z 19,35 ppm za AITC in 55,41 ppm za 4-HBITC (tabela 4). V primerjavi z AITC in BITC ima 4-HBITC nižjo toksičnost in višjo vrednost LC50. V najmočnejši semenski moki obstajajo pomembne razlike v toksičnosti dveh glavnih izotiocianatov (Ls in PG) za ličinke komarjev. Toksičnost na podlagi razmerja smrtnih odmerkov vrednosti LC50 med AITC, BITC in 4-HBITC je pokazala statistično razliko, tako da 95-odstotni IZ razmerja smrtnih odmerkov LC50 ni vključeval vrednosti 1 (P = 0,05, tabela 4). Ocenjeno je bilo, da najvišje koncentracije BITC in AITC ubijejo 100 % testiranih ličink (slika 2).
Krivulje umrljivosti so bile ocenjene iz odziva na odmerek (Probit) Ae. 24 ur po tretiranju so egiptovske ličinke (ličinke 3. instarja) dosegle koncentracije sintetičnega izotiocianata. Črtkana črta predstavlja LC50 za tretiranje z izotiocianatom. Benzil izotiocianat BITC, alil izotiocianat AITC in 4-HBITC.
Uporaba rastlinskih biopesticidov kot sredstev za zatiranje vektorjev komarjev je že dolgo preučevana. Številne rastline proizvajajo naravne kemikalije, ki imajo insekticidno delovanje37. Njihove bioaktivne spojine predstavljajo privlačno alternativo sintetičnim insekticidom z velikim potencialom pri zatiranju škodljivcev, vključno s komarji.
Gorčične rastline gojimo kot pridelek zaradi njihovih semen, uporabljamo jih kot začimbo in vir olja. Ko se gorčično olje ekstrahira iz semen ali ko se gorčica ekstrahira za uporabo kot biogorivo,69 je stranski produkt razmaščena semenska moka. Ta semenska moka ohrani številne svoje naravne biokemične sestavine in hidrolitične encime. Toksičnost te semenske moke se pripisuje nastajanju izotiocianatov55,60,61. Izotiocianati nastanejo s hidrolizo glukozinolatov z encimom mirozinazo med hidratacijo semenske moke38,55,70 in so znani po svojih fungicidnih, baktericidnih, nematocidnih in insekticidnih učinkih, pa tudi po drugih lastnostih, vključno s kemičnimi senzoričnimi učinki in kemoterapevtskimi lastnostmi61,62,70. Več študij je pokazalo, da gorčične rastline in semenska moka učinkovito delujejo kot fumiganti proti talnim in skladiščenim škodljivcem57,59,71,72. V tej študiji smo ocenili toksičnost štirisemenske moke in njenih treh bioaktivnih produktov AITC, BITC in 4-HBITC za ličinke komarjev vrste Aedes. Aedes aegypti. Pričakuje se, da bo dodajanje semenske moke neposredno v vodo, ki vsebuje ličinke komarjev, aktiviralo encimske procese, ki proizvajajo izotiocianate, strupene za ličinke komarjev. Ta biotransformacija je bila delno dokazana z opaženo larvicidno aktivnostjo semenske moke in izgubo insekticidne aktivnosti, ko je bila moka iz pritlikavih gorčičnih semen pred uporabo toplotno obdelana. Pričakuje se, da toplotna obdelava uniči hidrolitične encime, ki aktivirajo glukozinolate, s čimer prepreči nastanek bioaktivnih izotiocianatov. To je prva študija, ki potrjuje insekticidne lastnosti prahu iz zelja proti komarjem v vodnem okolju.
Med testiranimi semenskimi praški je bil prašek semen vodne kreše (Ls) najbolj strupen, saj je povzročil visoko smrtnost vrste Aedes albopictus. Ličinke Aedes aegypti so bile neprekinjeno obdelane 24 ur. Preostali trije semenski praški (PG, IG in DFP) so imeli počasnejšo aktivnost in so še vedno povzročali znatno smrtnost po 72 urah neprekinjene obdelave. Le semenska moka Ls je vsebovala znatne količine glukozinolatov, medtem ko sta PG in DFP vsebovala mirozinazo, IG pa glukozinolat kot glavni glukozinolat (tabela 1). Glukotropaeolin se hidrolizira v BITC, sinalbin pa v 4-HBITC61,62. Naši rezultati bioloških testov kažejo, da sta tako semenska moka Ls kot sintetični BITC zelo strupena za ličinke komarjev. Glavna sestavina semenske moke PG in DFP je mirozinazni glukozinolat, ki se hidrolizira v AITC. AITC je učinkovit pri ubijanju ličink komarjev z vrednostjo LC50 19,35 ppm. V primerjavi z AITC in BITC je 4-HBITC izotiocianat najmanj strupen za ličinke. Čeprav je AITC manj strupen kot BITC, so njihove vrednosti LC50 nižje od mnogih eteričnih olj, testiranih na ličinkah komarjev32,73,74,75.
Naš prah iz semen križnic za uporabo proti ličinkam komarjev vsebuje en glavni glukozinolat, ki predstavlja več kot 98–99 % vseh glukozinolatov, kot je bilo določeno s HPLC. Zaznane so bile sledi drugih glukozinolatov, vendar so bile njihove ravni manjše od 0,3 % vseh glukozinolatov. Prah iz semen vodne kreše (L. sativum) vsebuje sekundarne glukozinolate (sinigrin), vendar je njihov delež 1 % vseh glukozinolatov, njihova vsebnost pa je še vedno zanemarljiva (približno 0,4 mg/g prahu iz semen). Čeprav PG in DFP vsebujeta isti glavni glukozinolat (mirozin), se larvicidna aktivnost njunih semenskih obrokov bistveno razlikuje zaradi njihovih vrednosti LC50. Razlikuje se v toksičnosti za pepelasto plesen. Pojav ličink Aedes aegypti je lahko posledica razlik v aktivnosti mirozinaze ali stabilnosti med obema semenskima obrokoma. Aktivnost mirozinaze igra pomembno vlogo pri biološki uporabnosti produktov hidrolize, kot so izotiocianati, v rastlinah Brassicaceae76. Prejšnja poročila Pococka in sodelavcev77 ter Wilkinsona in sodelavcev78 so pokazala, da so spremembe v aktivnosti in stabilnosti mirozinaze lahko povezane tudi z genetskimi in okoljskimi dejavniki.
Pričakovana vsebnost bioaktivnih izotiocianata je bila izračunana na podlagi vrednosti LC50 vsakega semenskega obroka po 24 in 72 urah (tabela 5) za primerjavo z ustreznimi kemičnimi aplikacijami. Po 24 urah so bili izotiocianati v semenskem obroku bolj strupeni kot čiste spojine. Vrednosti LC50, izračunane na podlagi delcev na milijon (ppm) izotiocianatov pri tretiranju semen, so bile nižje od vrednosti LC50 pri aplikacijah BITC, AITC in 4-HBITC. Opazovali smo, da ličinke uživajo pelete semenskega obroka (slika 3A). Posledično so lahko ličinke bolj koncentrirano izpostavljene strupenim izotiocianatom z zaužitjem peletov semenskega obroka. To je bilo najbolj očitno pri tretiranjih semenskega obroka IG in PG pri 24-urni izpostavljenosti, kjer so bile koncentracije LC50 za 75 % oziroma 72 % nižje kot pri tretiranjih s čistim AITC oziroma 4-HBITC. Tretmaji Ls in DFP so bili bolj strupeni kot čisti izotiocianat, z vrednostmi LC50 za 24 % oziroma 41 % nižjimi. Ličinke v kontrolni skupini so se uspešno zabubile (slika 3B), medtem ko se večina ličink v skupini s semensko moko ni zabubila, razvoj ličink pa je bil znatno zakasnjen (slika 3B,D). Pri Spodopteralitura so izotiocianati povezani z zaostankom v rasti in razvojnim zamikom79.
Ličinke komarjev vrste Ae. Aedes aegypti so bile neprekinjeno izpostavljene prahu semen Brassica 24–72 ur. (A) Mrtve ličinke z delci semenske moke v ustnih delih (obkrožene); (B) Kontrolna obdelava (dH20 brez dodane semenske moke) kaže, da ličinke normalno rastejo in se začnejo zabubljati po 72 urah (C, D) Ličinke, tretirane s semensko moko; semenska moka je pokazala razlike v razvoju in se ni zabubila.
Mehanizma toksičnih učinkov izotiocianatov na ličinke komarjev nismo preučevali. Vendar pa so prejšnje študije na rdečih ognjenih mravljah (Solenopsis invicta) pokazale, da je zaviranje glutation S-transferaze (GST) in esteraze (EST) glavni mehanizem bioaktivnosti izotiocianata, AITC pa lahko tudi pri nizki aktivnosti zavira aktivnost GST. rdeče uvožene ognjene mravlje v nizkih koncentracijah. Odmerek je 0,5 µg/ml80. Nasprotno pa AITC zavira acetilholinesterazo pri odraslih koruznih rilčkah (Sitophilus zeamais)81. Podobne študije je treba izvesti za pojasnitev mehanizma aktivnosti izotiocianata pri ličinkah komarjev.
Z obdelavo DFP, inaktivirano s toploto, podpiramo predlog, da hidroliza rastlinskih glukozinolatov v reaktivne izotiocianate služi kot mehanizem za zatiranje ličink komarjev z gorčično moko. Semenska moka DFP-HT ni bila strupena pri testiranih odmerkih. Lafarga in sod.82 so poročali, da so glukozinolati občutljivi na razgradnjo pri visokih temperaturah. Pričakuje se tudi, da toplotna obdelava denaturira encim mirozinazo v semenski moki in prepreči hidrolizo glukozinolatov v reaktivne izotiocianate. To so potrdili tudi Okunade in sod.75, ki so pokazali, da je mirozinaza občutljiva na temperaturo, kar kaže, da je bila aktivnost mirozinaze popolnoma inaktivirana, ko so bila semena gorčice, črne gorčice in krvavice izpostavljena temperaturam nad 80 °C. Ti mehanizmi lahko povzročijo izgubo insekticidne aktivnosti toplotno obdelane semenske moke DFP.
Gorčična moka in njeni trije glavni izotiocianati so torej strupeni za ličinke komarjev. Glede na te razlike med semensko moko in kemičnimi obdelavami je lahko uporaba semenske moke učinkovita metoda zatiranja komarjev. Treba je določiti ustrezne formulacije in učinkovite sisteme za dajanje, da bi izboljšali učinkovitost in stabilnost uporabe semenskih praškov. Naši rezultati kažejo na potencialno uporabo gorčične moke kot alternative sintetičnim pesticidom. Ta tehnologija bi lahko postala inovativno orodje za zatiranje prenašalcev komarjev. Ker ličinke komarjev uspevajo v vodnem okolju in se glukozinolati v semenski moki po hidraciji encimsko pretvorijo v aktivne izotiocianate, uporaba gorčične moke v vodi, okuženi s komarji, ponuja pomemben potencial za zatiranje. Čeprav se larvicidna aktivnost izotiocianatov razlikuje (BITC > AITC > 4-HBITC), so potrebne nadaljnje raziskave, da bi ugotovili, ali kombiniranje semenske moke z več glukozinolati sinergistično poveča toksičnost. To je prva študija, ki dokazuje insekticidne učinke razmaščene križnice in treh bioaktivnih izotiocianatov na komarje. Rezultati te študije so orali ledino, saj kažejo, da lahko razmaščena moka iz zelja, stranski produkt ekstrakcije olja iz semen, služi kot obetavno larvicidno sredstvo za zatiranje komarjev. Te informacije lahko pomagajo pri nadaljnjem odkrivanju sredstev za biološko zatiranje rastlin in njihovem razvoju kot poceni, praktičnih in okolju prijaznih biopesticidov.
Podatkovni nizi, ustvarjeni za to študijo, in posledične analize so na voljo pri ustreznem avtorju na razumno zahtevo. Ob koncu študije so bili vsi materiali, uporabljeni v študiji (žuželke in semenska moka), uničeni.
Čas objave: 29. julij 2024